二代测序与分子克隆测序技术在HBV X基因准种变异研究中的应用及差异分析

目的　比较二代测序（next-generation sequencing,NGS）和克隆测序（clone-based sequencing,CBS）两种方法检测乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）X基因准种变异位点的差异。方法 在广西肝癌高危人群队列中选择发展成肝癌的病例（A）和无癌的对照（B）各1例为研究对象。自研究对象进入队列起,每半年采集外周血液5 mL,分离血清备用,直至病例Ａ肝癌发病,共收集研究对象血清12份。提取血清HBV DNA并采用巢式PCR法扩增HBV X基因区。PCR产物同时采用NGS和CBS两种方法检测HBV X基因区核苷酸序列,对两种方法获得的突变位点进行比较分析。结果 NGS共检测到HBV X基因区准种40个变异位点和1段插入突变（nt1649）,CBS共检测到41个变异位点和1段插入突变（nt1672~1673）。两种方法同时检测到的变异位点有29个,NGS检测到而CBS未检测到的变异位点有11个,NGS未检测到而CBS检测到的变异位点有12个。NGS和CBS两种方法均发现在肝病的进展中突变位点发生波动。结论 在研究HBV碱基变异方面,CBS和NGS发现变异位点的能力相当,CBS发现长片段插入和缺失的能力优于NGS,在实际应用时应根据研究目的选择相应的检测方法。     

广西肝癌高发区原发性肝细胞癌 HBV X 基因的整合及影响因素分析

目的 了解广西肝癌高发区乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）X区基因在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）染色体中的整合及影响因素。方法 以30例与HBV相关的原发性肝细胞癌患者为研究对象。提取HCC组织及癌旁组织标本DNA作为模板,以HBV X基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,应用重复序列-多聚酶链反应（Alu-PCR）扩增整合的HBV X片段及两侧的人类基因组DNA片段。扩增产物进行测序,计算目的片段整合率并分析相关的影响因素。结果 18例HCC组织检测到HBV X基因的整合片段,整合率为60.00%（18/30）;26例癌旁组织检测到HBV X基因的整合片段,整合率为86.67%（26/30）。癌旁组织HBV病毒整合率高于HCC组织,差异有统计学意义（χ²=5.445,P=0.020）。不同性别、年龄、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST的HCC癌组织及其癌旁组织HBV X基因整合率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 广西肝癌高发区癌旁组织比HCC组织HBV整合率高,说明HBV整合发生在感染早期。HBV X基因整合与HCC患者性别、年龄、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST无明显关系。     

广西肝癌高发区不同水源微囊藻毒素含量调查

目的 了解广西肝癌高发区扶绥县饮用水水体微囊藻毒素(microcystin,MC)污染状况。方法 采集扶绥县11个自然村水源水样及28个自然村的末梢水水样,同时记录采样时水温及pH值。采用酶联免疫吸附法测定水样中的MC含量。结果 (1)水源水和末梢水之间温度和pH值差异无统计学意义(P>0.05)。(2)水源水和末梢水MC平均浓度分别为(15.64±2.08) ng/L、(14.42±2.28) ng/L,两者差异无统计学意义(P>0.05)。水源水中河水MC浓度最高,为16.69 ng/L,其他依次为地下河水和井水,各种水源水间MC浓度差异无统计学意义(P>0.05)。末梢水中MC浓度从高到低依次为水库水、井水、地下河水和河水,来源不同的末梢水间MC浓度差异无统计学意义(P>0.05)。(3)经水厂处理和未经水厂处理的末梢水水样MC平均浓度分别为(13.90±2.62) ng/L、(14.71±2.09) ng/L,两者差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论 广西肝癌高发区扶绥县饮用水MC浓度均未超过WHO推荐的安全限值,不同水源水间的MC浓度无明显差异。     

广西扶绥县肝癌高危人群 HBV S 区基因突变与原发性肝癌的相关性研究

目的　探讨广西扶绥县肝癌高危人群乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）S区基因突变及其与原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）的关系。方法 收集来自扶绥县肝癌高危人群队列30例原发性肝癌患者为病例组,同时在队列中按条件收集30例未发生肝癌的持续HBsAg阳性者为对照组,两组1∶1匹配,收集血清标本。采用巢式PCR方法扩增出HBV S区基因片段,对扩增产物进行测序分析。结果 病例组和对照组突变率差异有统计学意义的突变点为T140A、T140C、T300C、G620A（P＜0.05）;条件logistic回归分析显示,T140C突变可能降低原发性肝癌发病风险（OR=0.484,95%CI：0.239~0.994）,T300C突变可能增加原发性肝癌发病风险（OR=2.911,95%CI：1.110~7.629）。结论 与原发性肝癌发生相关的HBV S区基因突变位点有T140A、T140C、T300C和G620A,其中T140C、T300C与原发性肝癌发生有独立相关性。