2015年中国克雅氏病监测病例特征分析

目的 了解中国克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)的发病情况、流行病学及临床特征。方法 对2015年我国CJD监测网络获得的可疑CJD病例的临床及流行病学资料进行分析,收集患者脑脊液及血液样品,利用Western Blot方法检测脑脊液中14-3-3蛋白,提取全血基因组DNA并利用PCR及测序方法对PRNP基因进行129位多态性及基因突变分析。结果 2015年共监测病例366例,其中散发型CJD临床诊断病例134例,疑似诊断病例29例,致死性家族型失眠症病例4例,吉斯特曼-斯特劳斯综合征病例1例及家族型CJD病例17例,包括11例T188K、4例E200K、1例E196K及1例E196A突变。病例报告无季节聚集性,长久居住地呈散在分布,职业分布广泛。临床诊断病例平均年龄为63岁,男女性别比为1.13:1;疑似诊断病例平均年龄为60岁,男女性别比为1.64:1。快速进行性痴呆为最常见的首发症状,占全部诊断病例的36.81%。临床诊断病例比疑似诊断病例出现更多的典型临床表现。结论 2015年我国监测到的CJD病例以散发型为主,病例的报告时间、长久居住地分布、职业分布、性别比例以及年龄分布均符合散发型CJD的特点。     

核转录因子-B(p65)在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中变化的研究

目的 研究NF-B（p65）在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中的变化。方法 通过蛋白质免疫印迹法及免疫组织化学的方法检测p65在139A感染的脑组织均浆中的含量变化。利用免疫荧光方法检测p65在神经元及胶质细胞中的分布情况。结果 在139A感染终末期小鼠脑组织均浆中，p65含量下降，差异有统计学意义。对感染不同时间点的动态分析结果显示，p65含量呈先升高随后逐渐降低趋势。免疫组织化学显示，139A感染终末期小鼠大脑皮层p65含量明显下降。免疫组织荧光显示在正常和139A感染终末期小鼠脑组织中，p65与神经元细胞存在共定位现象。结论 NF-B（p65）在小鼠中枢神经系统中主要分布于神经元细胞，在139A感染的小鼠终末期脑组织中，p65总量明显下降，提示在139A感染的小鼠脑组织中，NF-B（p65）出现了变化，在疾病进程中发挥一定作用。     

人朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及抗体的制备

目的克隆、表达和纯化人朊蛋白相关Shadoo（SHO）蛋白并制备抗Shadoo的多克隆抗体。方法提取仓鼠各组织的mRNA，分析SHO基因在仓鼠各组织中转录水平的差异;提取人DNA，PCR方法获得人SHO基因，克隆至融合表达载体，在大肠埃希菌中表达人SHO蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清，用Western blot方法分别检测与重组及内源性SHO蛋白的免疫反应性。结果SHO基因在仓鼠各组织中的转录水平差异很大，脑组织转录水平高。在大肠埃希菌中表达了分子质量单位为37 ku的人SHO融合蛋白，制备的SHO蛋白抗体可与重组的SHO蛋白反应，可识别内源性的SHO。结论成功表达纯化人SHO融合蛋白并制备了抗SHO抗体，为研究SHO和正常朊蛋白之间的关系打下初步基础。     

遗传性朊病毒病额叶脑组织差异蛋白质组学研究CSCD

目的 应用蛋白质组学方法,筛选遗传性朊病毒病（Prion disease）额中回皮质差异表达蛋白以探究朊病毒病的发病机制和干预靶点.方法 对我国经临床、病理及分子生物学方法确诊的3例遗传性朊病毒病尸检脑组织额中回皮质,以3例同年龄组的心脏猝死且无神经系统病变的尸检脑组织为对照,进行了差异蛋白质组研究.应用荧光双向差异凝胶蛋白电泳、MALDI-TOF/MS串联质谱仪进行差异蛋白质谱分析.Mascot search results软件进行搜库,确定差异表达蛋白.结果 表达上调的蛋白有：半乳糖凝集素-1（Galectin-1,Gal-1）;泛素（Ubiquitin）;兰尼碱受体2（Ryanodine receptor 2,RyR2）;肌动蛋白结合蛋白（Profilin-2,PFN2）;Rab相互作用溶酶体蛋白样蛋白-1（Rab-interacting lysomes protein-like protein 1,RILPL-1）;髓鞘碱性蛋白异构体4（Isoform 4 of myelin basic protein）;表达下调的蛋白是血色素β亚单位（Hemoglobin subunit beta）.结论 结合文献分析其中泛素、Gal-1、RyR、PFN2和RILPL-1可能与遗传性朊病毒病发病机制关系更为密切.Gal-1可能在朊病毒病中发挥内源性神经保护机制;RyR2与记忆及肌阵挛有关;泛素、RILP-1与错误折叠蛋白质清除有关;PFN2可能与神经变性病的轴浆运输障碍有关.     

Prion疾病疫苗研究策略

朊病毒病是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的致死性退行性脑病,目前缺乏有效的预防和治疗方法.朊病毒病的重组蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、树突状细胞疫苗、黏膜免疫疫苗等已取得一定进展,但现有的免疫策略仅能部分克服免疫耐受,诱导较低或中等滴度的抗体,对PrPSc感染动物模型只能提供部分保护,Prion疫苗研究任重而道远.     

羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠后半数致死量(LD_(50))的测定

目的测定羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠后的LD50。方法将感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织用生理盐水制成10%(w/v)脑组织匀浆,梯度稀释后感染仓鼠,观察仓鼠的发病情况。以Reed-Muench公式计算LD50,用West-ern blot方法检测观察期结束后发病及仍存活的仓鼠脑组织、脾组织中抵抗蛋白酶K的PrPSc。结果当颅内接种稀释度由低到高变化时,仓鼠发病的潜伏期及病程同时也由短到长发生变化。发病仓鼠脑组织中可以检测到PrPSc,但是PrPSc的量在不同的组之间无太大差别。观察期结束后,仍存活的仓鼠脑组织中未检测到具有PK抗性的PrP信号。结论本实验室保存的羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠的LD50为9.2-log10LD50i.c.units/0.001g brain,即当对仓鼠颅内接种10μl羊瘙痒因子263K的10-9.2稀释液时,50%的仓鼠会死亡。     

40岁以上高龄妊娠与分娩结局分析(附56例临床报告)

目的 探讨40岁以上妊娠妇女对分娩的影响.方法 回顾性分析1995年12月～2005年12月分娩的40岁以上孕妇56例及同期妊娠的18～34岁孕妇100例,后者为对照组.结果 高龄组不孕史、习惯性流产和子宫肌瘤发生率高于对照组(P＜0.01或P＜0.0 5);高龄组剖宫产率(78.6%)比对照组(38%)高(P＜0.01).但两组的新生儿出生体重、新生儿窒息、新生儿畸形和围生儿死亡率则没有明显差异(P＞0.05).结论 40岁以上妇女妊娠的并发症及剖宫产率增高,但只要重视和加强管理,积极预防和治疗合并症,母儿预后较好.     

人乳头瘤病毒16型长控制区域上YY1位点的缺失可增强病毒对小鼠纤维细胞的转化能力

目的人乳头瘤病毒（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）１６型早期启动子Ｐ９７控制着病毒癌基因的表达。为了观测长控制区（Ｌｏｎｇｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ，ＬＣＲ）上ＹＹ１结合位点的破坏对病毒转化能力的影响。方法构建了带有自然发生突变ＬＣＲ序列的ＨＰＶ１６全基因质粒，利用ＥＭＳＡ和荧光素酶实验检测小鼠纤维细胞胞核内源性ＹＹ１蛋白存在和功能状态；将标准及突变的ＨＰＶ１６毒株转染至Ｃ１２７细胞进行软琼脂糖培养基生长实验。结果与上皮类细胞相似，在Ｃ１２７胞核提取物中可检出ＹＹ１蛋白，并且具有良好的ＤＮＡ结合功能和Ｐ９７活性抑制作用。转化实验显示ＹＹ１位点突变ＨＰＶ１６毒株可在软琼脂糖培养基上形成２～１０倍量多的生长集落。结论细胞转录调节因子ＹＹ１存在于啮齿类动物纤维细胞胞核中；ＬＣＲ上ＹＹ１结合位点的破坏可在完整基因组范围内明显增强病毒对小鼠纤维细胞的转化能力。     

人tau蛋白外显子2和外显子3特异性抗体的制备

目的 制备人微管相关蛋白tau N端的外显子2和外显子3特异性多克隆抗体.方法 从人外周血DNA中获得tau蛋白外显子2及外显子3序列并连接至原核表达载体pGEX-2T,表达纯化重组融合蛋白GST-E2、GST-E3;以此融合蛋白免疫家兔及小鼠制备抗血清,通过ProteinG/A、偶联GST蛋白的溴化氰(CNBr)活化柱对抗血清进行亲和纯化;用Western Blot及ELISA方法确定所制备抗体的特异性和敏感性.结果 在大肠埃希菌中表达纯化出人tau外显子2和外显子3重组融合蛋白GST-E2和GST-E3,相对分子质量为29×103.免疫实验动物后获得抗血清,经系列纯化后Western Blot和ELISA检测显示,制备的抗人tau蛋白外显子2和外显子3抗体具有良好的特异性和免疫反应效价.结论 成功制备了4种人tau外显子2和外显子3特异性抗体,为进行tau蛋白在神经退行性疾病中的作用研究提供了基础.