转染胸苷磷酸化酶基因对5'-脱氧氟脲苷抗结肠癌细胞株活性的影响

目的 探讨人结肠癌细胞系SW480和LOVO细胞株转染胸苷磷酸化酶(TP)基因后转化5′-脱氧氟脲苷(5′-DFUR)为氟尿嘧啶(5-FU)能力的变化及5′-DFUR抗癌细胞株活性的变化.方法 构建包含TP cDNA的真核表达载体,用慢病毒包装后转染结肠癌细胞株SW480和LOVO.转染5代后以免疫荧光法和流式细胞技术检测转染效率;RT-PCR和Western blot法分别检测2株细胞的TP mRNA和TP蛋白表达.然后以高效液相色谱法(HPLC)检测2株细胞转染前后转化5′-DFUR为5-FU的量;MTT法检测5′-DFUR对2株细胞转染前后半数抑制浓度(IC50).结果 转染TP基因后SW480-TP与LOVO-TP 5代细胞转染效率稳定在95％左右.2株转染细胞的TP mRNA表达分别比野生型细胞增加(695±172)倍(t=-7.00,P=0.002)和(282±87)倍(t=-5.61,P=0.030),Western blot显示TP蛋白表达也明显增强.转染后的SW480-TP与LOVO-TP在培养基中分别使5′-DFUR转化为5-FU的量增加(t=19.406 ～66.921,P＜0.01).5′-DFUR对SW480的IC50由(1641±53) μmol/L降至(587±17) μmol/L(t=-32.59,P＜0.01);对LOVO的IC50由(1607±57) μmol/L降至(1088±89) μmol/L(t=-8.52,P＜0.01).结论 慢病毒载体能够高效地将TP cDNA转染至人结肠癌细胞SW480和LOVO并稳定传代,转染后2株细胞的TP mRNA和TP蛋白表达明显增高,使5′-DFUR转化为5-FU的量增加,对结肠癌细胞株SW480和LOVO的抑制作用增强.     

干扰素α2a对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶表达和5′-脱氧氟尿苷抗癌活性的影响

目的 探讨干扰素-α2a(IFN-α2a)对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶(TP)mRNA表达水平以及5′-脱氧氟尿苷(5′-DFUR)和氟尿嘧啶(5-FU)抗癌效应的影响.方法 不同剂量IFN-α2a分别处理人结肠癌细胞LOVO和SW480,荧光定量PCR检测TP mRNA表达水平;MTT法检测联合应用IFN-α2a前后5-FU和5′-DFUR对LOVO和SW480抑制作用的半数有效浓度(IC50)变化情况.结果 与0 U/ml IFN-α2a浓度组相比,500 U/ml及5000 U/ml组可明显上调LOVO和SW480细胞TPmRNA表达(P＜0.01),而50 U/ml则对上述两种细胞TPmRNA表达水平无明显影响(P＞0.05).联合应用浓度为20 U/ml的IFN-α2a后,5-FU对LOVO和SW480细胞的IC50无明显改变(P＞0.05),但5′-DFUR的IC50则明显降低(P＜0.05).结论 IFN-α2a能上调结肠癌细胞TP mRNA的表达水平,并可使5′-DFUR对结肠癌细胞的IC50明显下降,而对5-FU则无明显影响.     

5’-脱氧氟尿苷联合干扰素对转染TP基因结肠癌细胞株裸鼠实验模型的影响

背景与目的：人结直肠癌细胞基本无胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)表达。本实验主要探讨人结肠癌细胞株LS174T转染TP基因后,在裸鼠肿瘤组织中对抗癌药物5’-脱氧氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine,5’-DFUR)、氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和干扰素-α2a(interferon-α2a,INF-α2a)干预效果的影响。方法：以慢病毒为载体转染TP基因至结肠癌细胞株LS174T,得到稳定传代的高TP表达株。将96只BALB/c裸鼠分成2组,分别应用野生型及转染TP基因后的LS174T细胞株接种裸鼠背部皮下,制成结肠癌TP低、高表达模型。每组再随机分为6组,分别应用0.9%NaCl溶液、INF-α2a、5-FU、5-FU+INF-α2a、5’-DFUR和5’-DFUR+INF-α2a干预5 d,2周后处死裸鼠,分离肿瘤称重后,分别应用鼠抗人CD34、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和抗PD-ECGF单克隆抗体进行免疫组织化学染色。判定是否有TP表达及对微血管进行计数。结果：在野生型LS174T裸鼠荷瘤模型中,使用抗肿瘤药物的3~6组肿瘤质量与对照组相比均明显降低,抑癌率分别为48%、27%、48%和57%,差异有统计学意义(P<0.05)。其中5’-DFUR组(48%)与5’-DFUR+INF-α2a组(57%)、5-FU+INF-α2a组与5’-DFUR+INF-α2a组(27%与57%)相比,抑癌率差异有统计学意义(P<0.05)。在LS174T-TP细胞株裸鼠模型中,5’-DFUR组和5’-DFUR+INF-α2a组抑癌率分别为27%和48%,而使用5-FU的两组未显示出良好的抗肿瘤效果(7%和3%)。免疫组织化学染色显示,野生型LS174T接种形成的肿瘤组织中TP表达阴性,微血管数目较少,而转染TP基因后,肿瘤组织中TP表达明显上升,微血管密度明显增多(P<0.05)。结论：结肠癌细胞株LS174T转染TP基因后,在裸鼠实验肿瘤模型中,TP表达明显增加,使细胞内激活抗癌药物5’-DFUR的抗癌作用明显增强,联合应用INF-α2a能进一步增强这种抗癌作用。而转染TP基因或联合应用INF-α2a对常规抗癌药物5-FU的抗癌效果无明显影响。     

石菖蒲挥发油及β-细辛醚的抗血栓作用

目的研究石菖蒲挥发油及β-细辛醚的抗血栓作用。方法通过血栓形成试验、高黏血症试验、凝血试验和体外溶纤试验，考察石菖蒲挥发油和β-细辛醚对血栓重量、凝血酶原时间（胛）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血液流变学、小鼠凝血时间、血浆纤维蛋白凝块重量等指标的影响。结果石菖蒲挥发油、β-细辛醚能减轻大鼠静脉血栓重量，延长大鼠血浆PT和APTT；改善高黏血症大鼠的血液流变性，尤其对全血低切黏度和血浆黏度的作用明显；明显延长小鼠凝血时间；减轻血浆纤维蛋白凝块的重量。结论石菖蒲挥发油、β-细辛醚有抑制血栓形成、抗黏、抗凝、溶解血浆纤维蛋白的作用，其作用机制可能与其能延长PT、APTT，改善血液黏滞性等有关。     

β-细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞线粒体膜电位的影响

目的观察石菖蒲有效成分β-细辛醚对缺血再灌注损伤(MIRI)心肌细胞线粒体膜电位(MMP)的影响。方法采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)建立心肌细胞MIRI模型,将原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞分6组:正常对照组、MIRI模型组、β-细辛醚高、中、低剂量组(25,12.5,6.25μg/mL)、基质组。利用流式细胞术(FCM)检测MMP平均荧光强度。结果MIRI模型组心肌细胞MMP明显降低,与正常对照组比较有统计学意义(P<0.05);β-细辛醚能不同程度升高MMP,与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。结论β-细辛醚能有效抑制MIRI心肌细胞线粒体的损伤,稳定MMP。     

5’-脱氧氟尿苷治疗BALB/C小鼠结肠癌实验模型

目的 通过对BALB/C小鼠原位结肠癌实验模型应用5’-脱氧氟尿苷治疗,并同传统抗癌药物5-氟尿嘧啶进行比较,观察分析5’-脱氧氟尿苷在动物体内抗结肠癌细胞效应及在组织和血液中的转化.方法 60只BALB/C小鼠采用盲肠原位瘤块接种法建立小鼠结肠癌CT26实验模型,术后第3天开始用随机数字表法把小鼠分成3组,每组20只.根据体重分别连续5d腹腔注射:(1)5’-脱氧氟尿苷组:5’-脱氧氟尿苷0.1 mg/g;(2)5-FU组:5-FU 0.02 mg/g;(3)对照组:0.9％氯化钠溶液0.4mL.每组分别于术后第2、3周处死6只小鼠,测量肿瘤重量和体重变化,检测血常规和肝肾功能,并各保留8只小鼠等待自然死亡记录带瘤生存时间.另外把14只小鼠皮下接种CT 26细胞约2周后,待注射局部形成皮下肿物,用随机数字表法分成2组,每组各7只,分别腹腔注射5’-脱氧氟尿苷0.1 mg/g和5-氟尿嘧啶0.02 mg/g,15 min后同时处死取血和肿瘤组织测定转化后的5-氟尿嘧啶含量.结果 5’-脱氧氟尿苷组小鼠肿瘤重量最小,术后2周和3周平均重量分别为(0.07±0.12)g和(0.24±0.29)g;平均带瘤生存期为(32.6±8.9)d.5-氟尿嘧啶组术后2周和3周平均肿瘤重量分别为(0.74±0.43)g和(1.13±0.75)g,平均带瘤生存期为(22.8±5.9)d.对照组术后2周和3周平均肿瘤重量分别为(0.70±0.47)g和(1.93±0.83)g,平均带瘤生存期为(17.5±2.8)d.5’-脱氧氟尿苷组小鼠肿瘤重量、带瘤生存期与5-氟尿嘧啶组及对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).各组小鼠在WBC、Hb、Pit、肝肾功能方面差异无统计学意义(P＞0.05),但5-氟尿嘧啶组在手术及应用药物后体重下降比较明显,与5’-脱氧氟尿苷组及对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01).5’-脱氧氟尿苷组小鼠在注药15 min后肿瘤组织中检出5-氟尿嘧啶浓度为(54.71±12.82) μg/g,为同期血清中浓度的6.20倍(P＜0.05).5-氟尿嘧啶组小鼠注药15 min后,血清中检出5-氟尿嘧啶浓度为(133.35±20.69)μg/mL,为癌组织的1.55倍(P＜0.05).结论 5’-脱氧氟尿苷在BALB/c小鼠结肠癌模型中可以转化为5-氟尿嘧啶,并且癌组织中浓度高于血清浓度.5’-脱氧氟尿苷在小鼠体内抑瘤效果高于传统药物5-氟尿嘧啶,小鼠带瘤生存期长,全身不良反应轻微.     

基于基因转染法的胸苷磷酸化酶高表达结肠癌细胞株的建立

目的：构建表达高度胸苷磷酸化酶（TP）活性并可以稳定传代的结肠癌细胞株。方法合成包含TP cDNA 全长的真核细胞表达载体,用慢病毒包装后转染人结肠癌细胞株 SW480、LOVO、HT29和 LS174T,流式细胞仪检测转染效率,实时荧光定量 RT －PCR 方法检测 TP 的 mRNA 表达,蛋白印迹法（Western blot）检测 TP 蛋白表达。结果转染 TP cDNA 后,SW480、LOVO、HT29与 LS174T 在传代5代后转染效率仍稳定在95％左右。与未转染 TP 基因的亲代细胞相比,SW480－TP、LOVO －TP、HT29－TP 与 LS174T －TP 的 TP mRNA 的表达分别提高了（694．56±171．53）、（282．46±86．85）、（8．45±0．15）和（2615．02±253．97）倍,差异有统计学意义（P ＜0．05）;并且 TP 蛋白的表达水平也显著提高。结论慢病毒载体能够高效地将 TP cDNA 转染至人结肠癌细胞 SW480、LO－VO、HT29和 LS174T 中,所得克隆能够稳定传代,并能显著提高4株结肠癌细胞 TP 的 mRNA 和蛋白表达水平。     

β-细辛醚对缺血—再灌注损伤心肌细胞的保护作用

[目的]观察石菖蒲有效成分β-细辛醚对缺血-再灌注损伤(MI-RI)心肌细胞的保护作用.[方法]培养原代乳鼠心肌细胞,采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)复制心肌细胞MI-Rl模型,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率,紫外分光光度法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量,利用流式细胞术(FCM)检测线粒体膜电位(MMP)平均荧光强度.[结果]β-细辛醚能显著提高MI-RI模型细胞存活率,降低培养液中LDH、CK的含量,提高MMP值(均P＜0.05).[结论]β-细辛醚时MI-RI心肌细胞具有保护作用,其作用机理可能与减轻细胞膜损伤,降低线粒体膜通透性有关.     

穴位注射足三里治疗腰椎间盘突出症的临床观察

目的：观察维生素B12穴位注射足三里为主保守治疗腰椎间盘突出症与对照组的临床疗效。方法：将120例患者随机分为治疗纽（60例）和对照组（60例）,两组均采用中药熏洗、理疗等综合治疗,治疗组加用维生素B12穴位注射足三里,两个疗程后比较疗效。结果：治疗组总有效率78．33％,疼痛改善率83．33％;对照组的总有效率65．00％,疼痛改善率70．00％。;两组总有效率及疼痛症状改善率比较均有显著性差异（P〈0．05）。结论：穴位注射足三里是治疗腰椎间盘突出症的有效方法。     

关节镜下前交叉韧带重建术后护理与康复

膝关节前交叉韧带(ACL)的主要功能是防止胫骨前后错动及膝旋转不稳,对完全断裂者应手术治疗[1],其中关节镜手术是一种比较安全实用的新技术,具有诊断率高、微创、恢复快、并发症少,术后痛苦少等优点[2].