兔主动脉内皮细胞制备方法的优化

目的为构建骨组织工程血管化提供优质种子细胞。方法采用血管内膜外翻和胶原酶消化法分离培养兔主动脉内皮细胞并传代;采用倒置显微镜、透射电镜观察和免疫荧光法鉴定。结果培养的血管内皮细胞在第3~5天为对数生长期,倒置显微镜下可见内皮细胞呈紧密排列、短梭多角形的"鹅卵石"形态;透射电镜可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体;经免疫荧光法鉴定证明该细胞CD31抗原阳性。结论采用血管内膜外翻等方法制备的兔血管内皮细胞的成活率高,且纯度高、数量多、具有良好的生物学活性。该法可为骨组织工程血管化的研究提供种子细胞。     

腺病毒介导转化生长因子β1基因阻逆兔椎间盘退行性变的实验

目的:观察腺病毒载体搭载的人转化生长因子基因对兔椎间盘退行性变模型的治疗作用。方法:实验于2003-03/2004-09在协和医院骨科实验室进行。取4个月龄健康雌性日本大白兔30只,于协和医院骨科实验室行L4～5,L5～6前外侧纤维环损伤手术以构建椎间盘退行性变模型。术后8周将动物随机分入3组。治疗组14只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因;对照组8只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导标志基因(Ad/CMV-LacZ);空白组6只,注射20μL生理盐水。另取2只同类的健康白兔作为正常对照,不予任何手术或治疗。注射后3周取各组椎间盘组织行苏木精-伊红染色、T2加权磁共振成像、蛋白免疫印迹、转化生长因子β1免疫组织化学观察。结果:①兔椎间盘组织切片观察结果:注射3周后,治疗组切口已基本愈合,髓核细胞大量增生;空白组纤维环外侧内2/3部分仍未愈合,部分髓核细胞坏死、凋亡;对照组较空白组改善不明显。②MRI扫描结果:治疗组椎间盘信号较对照组及空白组有所恢复,但并未完全达到正常椎间盘水平。③蛋白质免疫印迹分析结果:治疗组转化生长因子β1含量较对照组和空白组有显著上升(P<0.01)。④转化生长因子β1免疫组织分析结果:治疗组转化生长因子β1为强阳性表达(>50%),空白组几乎没有转化生长因子β1表达,对照组与空白组相似。治疗组显著高于对照组(χ2=20.563,P=0.00)。结论:腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因转染退行性变的椎间盘细胞能够有效提高髓核细胞内转化生长因子β1含量,阻逆椎间盘退行性变。     

骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染小鼠骨髓基质干细胞的体内诱导成骨

目的：观察骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子。双基因转染的小鼠骨髓基质干细胞是否具有异位诱导成骨能力。方法：脂质体介导下将pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞，用RT-PCR和免疫组织化学法观察骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达：将转染双基因的小鼠骨髓基质干细胞植入裸鼠大腿后群肌袋内，4周后用影像学和组织学方法观察体内诱导成骨效果。结果：转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞扩增出1．2kb及590bp两条带，胞浆中有棕黄色颗粒阳性信号。该细胞植入裸鼠大腿后群肌袋4周后有大量异位骨形成。结论：转染骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因的小鼠骨髓基质干细胞具有较强诱导异位成骨能力。     

不对称经椎弓根截骨矫治成人先天性脊柱侧后凸畸形

【摘要】 目的：分析应用不对称经椎弓根截骨技术矫治成人先天性脊柱侧后凸畸形的临床疗效。方法：2009年9月~2013年10月采用不对称经椎弓根截骨矫治成人先天性脊柱侧后凸畸形患者16例,男9例,女7例。年龄18～42岁,平均23.6岁。均有腰背痛,无神经受压症状。16例患者脊柱侧凸Cobb角43°~97°,后凸Cobb角15°~70°。侧凸畸形和后凸畸形顶椎均位于同一节段,其中顶椎位于胸椎10例、腰椎6例。于术前、术后及末次随访时在X线片上测量脊柱冠状面主弯Cobb角、矢状面后凸角、冠状面平衡及矢状面平衡,比较术前、术后及末次随访时影像学参数评估手术矫形效果。于术前、末次随访时填写SRS-22问卷量表,评估患者术后的生活质量变化。结果：手术融合节段5~12个,平均7.23个节段。手术时间3~7h,平均4.26h。术中出血量700～2500ml,平均1265ml。1例L1部位截骨患者术后出现双下肢痛觉过敏,急诊手术探查发现截骨部位硬脊膜皱褶,脊髓受压,对截骨部位椎板切开减压,术后症状明显好转,术后3个月随访神经症状消失。2例患者术后出现一侧胸腔积血,紧急行胸腔闭式引流术,1周后拔除引流管。15例患者获得6～48个月（平均13.4个月）随访。获得随访的15例患者冠状位主弯Cobb角术前为58.67°±20.36°（43°～97°）,术后为20.32°±8.76°（8°～37°）,末次随访时为21.76°±8.34°（10°～41°）,术后与术前比较差异有统计学意义（P<0.01）,矫正率为50.76%~82.36%,平均为65.36%,末次随访时与术后比较丢失率为2.45%。术前矢状位后凸角度为45.62°±16.26°（15°～70°）,术后为16.35°±16.87°（-20°～40°）,末次随访时为18.27°±13.92°（-15°～40°）,术后与术前比较差异有统计学意义（P<0.01）,矫正率为50.97%~79.32%,平均为64.16%,末次随访时与术后比较丢失率为4.2%。15例患者中,6例术前存在冠状面失平衡,术后均恢复平衡;4例术前存在矢状面失平衡,术后3例恢复平衡,1例仍为失平衡。SRS-22问卷量表总得分由术前66.47±12.35分（49～79分）提高至末次随访时的84.13±6.42分（76～92分）（P<0.01）。15例患者均获得骨性融合,无假关节形成或内固定断裂。结论：应用不对称经椎弓根截骨技术矫治先天性脊柱侧后凸畸形,可获得较好的矫形效果,显著改善患者躯体外观及躯体平衡,同时明显改善患者的生活质量。     

半月板成型缝合术在盘状半月板撕裂中的近期临床效果评价

目的评价半月板成形术结合Fastfix及MM-Ⅱ缝合技术在膝关节外侧盘状半月板撕裂中的近期临床效果。方法 2010年1月至2012年12月,对59例膝关节盘状半月板撕裂患者进行了半月板成型及缝合术。根据撕裂的大小和部位,采用Fast-fix缝合系统及MM-Ⅱ缝合套管针进行缝合。59例随访12~26个月,平均（18.4±3.6）个月。在术前及术后随访时记录患者的膝关节活动度、稳定性及Lysholm评分,比较术前及末次随访的Lysholm评分来评价盘状半月板成型缝合术的近期临床疗效。结果所有病例在末次随访时没有关节交锁及失稳症状,关节活动度均恢复正常。Lysholm评分从术前（58.8±6.8）分提高至术后（93.3±2.4）分,经t检验差异有统计学意义（t=-38.24,P〈0.01）。结论对于膝关节盘状半月板合并撕裂,在进行成型手术后通过Fast-fix及MM-Ⅱ对半月板撕裂进行缝合修复,可获得满意近期疗效。     

三七总皂苷干预脊髓损伤大鼠诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化

目的：观察三七总皂苷注射液对大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的作用机制。方法：实验于2005—06／1l在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。将64只SD大鼠数字表法随机分为损伤组和三七总皂苷组（n=32），2组按存活时间分为1，3，7，14d4个时间点，每个时问点8只。所有大鼠采用Allen’s法制备脊髓中度损伤模型（致伤能量为40g&;#183;cm），三七总皂苷组伤后30min腹腔注射50mg／L三七总皂苷100mg／kg，伤后2h及4h再次给予50mg／kg，以后1次／d，剂量200mg／kg，连用12d。损伤组相同时间点腹腔注射等体积生理盐水。2组均于预定对间点处死大鼠，取出伤段脊髓（以损伤处为中心，长约10mm），用苏术精-伊红染色观察损伤脊髓组织病理变化，免疫组化染色检测诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率。结果：64只大鼠全部进入结果分析。①苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂苷组明显轻于损伤组。②诱导型一氧化氮合酶阳性细胞率：三七总皂苷组在伤后1，3，7，14d均低于损伤组[（21．38&;#177;3．69）％。（36．24&;#177;3．27）％，（30．56&;#177;2．89）％．（21．64&;#177;5.31）％；（39．48&;#177;3．78）％。（58，69&;#177;5．67）％。（68．97&;#177;5．34）％，（40．35&;#177;4．36）％。t=9．692，9．701，17．893，3．171，P〈0．05]。⑧半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率：三七总皂苷组在伤后1，3，7，14d均低于损伤组[（26．29&;#177;3．21）％，（35，42&;#177;2．25）％，（48．58&;#177;2．64）％。（23．72&;#177;3．26）％：（32．43&;#177;2，69）％，（46、18&;#177;3．07）％，（60．31&;#177;5．35）％，（31，98&;#177;4、80）％，t=4．147。7．996，5．561，11．231，P〈0．05]。结论：三七总皂苷注射液能抑制脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达，从而减轻细胞损伤和凋亡。     

组织工程化凝胶诱导股骨头坏死血管化的实验研究

目的验证内皮细胞和平滑肌细胞(EC/SMC)移植可通过促进血管生成和骨再生治疗股骨头坏死。方法先建立无水乙醇诱导兔股骨头坏死模型,将制备的组织工程聚合物凝胶注射到骨坏死区域。分为未干预组、细胞/凝胶组、微球/凝胶组、细胞/微球/凝胶组,干预后第2、4、6周,通过影像学(X线和MRI)和组织病理学(HE染色)检测股骨头坏死后血管和骨组织再生。使用Image-Pro Plus图像分析软件对新生血管密度进行分析。结果 X线、MRI和组织病理学检测均显示骨坏死面积缩小,新生毛细血管和新生骨修复坏死区域。图像软件定量分析细胞/微球/凝胶组的新生血管密度明显高于其它各组。结论骨坏死区域形成稳定和功能成熟的血管网证明EC/SMC在治疗性血管再生的作用。局部注射组织工程化凝胶提供了治疗早期股骨头坏死的新方法。     

采用下腹正中切口手术治疗骨盆前环复杂骨折

目的探讨采用下腹正中切口（Stoppa入路）手术在治疗骨盆前环复杂骨折中的临床经验与治疗效果。方法对2008年2月～2009年5月应用Stoppa入路治疗的11例骨盆前环复杂骨折患者临床资料进行总结。按照Tile分类：B2型6例,B3型3例,C2型2例。手术采用Stoppa入路,其中4例采用前环钢板固定,4例采用前环钢板和外固定器固定,3例采用前环钢板和骶髂螺钉固定。结果 Stoppa入路平均切口长度12cm（10～14cm）,平均手术时间100min（80～120min）,平均出血500ml（300～800ml）。11例前环损伤均复位满意,无手术并发症。9例术后获得8～10个月随访,均获骨性愈合。结论 Stoppa入路具有操作简单、解剖清晰、切口小、并发症少、恢复快的特点。在治疗骨盆前环复杂骨折时,Stoppa入路是非常合适的选择。     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景将生物材料复合细胞因子基因,或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复.目的观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性.设计对照观察实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科.对象新生SD大鼠5只,雌雄不限.方法实验于2000-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导入大鼠成骨细胞,并以质粒pcDNA3转染细胞作为对照.转染24 h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况.采用G418筛选转染细胞2周,获得阳性细胞克隆,用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况.主要观察指标链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况.结果①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果24 h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒,对照组空载体转染细胞胞浆中则没有棕黄色颗粒,说明转基因细胞中转化生长因子β1 mRNA明显增高.②G418筛选转基因细胞组化检测G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β1表达.结论利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子,转染后瞬时和筛选2周后,均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达,说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性.     

转铁蛋白-多聚乙烯亚胺介导IL-12基因对小鼠抗骨肉瘤免疫的增强作用

目的：研究以转铁蛋白一多聚乙烯亚胺(transferririn-polyethylenimine．Tf-PEI)为靶向性载体，体内转染小鼠白细胞介素12(murine interleukin-12，mIL-12)基因治疗小鼠骨肉瘤模型的疗效。方法：分别以PEI和Tf-PEI为载体，将mIL-12基因导人体外培养的小鼠骨肉瘤细胞，并观察游离转铁蛋白对Tf-PEI转染效率的影响。建立小鼠骨肉瘤动物模型，在荷瘤部位将Tf-PEI包裹mIL-12基因直接注入肿瘤中，检测此基因在肿瘤细胞中的蛋白表达情况和小鼠脾脏自然杀伤细胞(NK)、细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活性。结果：Tf-PEI组mIL-12蛋白表达效率显著高于PEI组(f=38．15，P&;lt;0．001)。游离转铁蛋白可显著抑制Tf-PEI组的转染效率(1=44．36，P&;lt;0．001)。在注射有mIL-12基因的肿瘤组织中，小鼠IL-12蛋白水平明显升高，为(72&;#177;5)ng／L(F=3．449，P&;lt;0．001)，小鼠脾细胞：NK，CTL活性增强(t=5．04，t=6．13，P&;lt;0．001)。结论：Tf-PEI是一种高效率的肿瘤靶向性基因转染载体，它可以成功的将mIL-12基因导入小鼠骨肉瘤模型，mIL-12基因治疗可提高机体的抗肿瘤免疫应答。