幼龄成骨细胞移植促进骨质疏松性骨折愈合中不同类型一氧化氮合酶的动态表达

目的:追踪观察移植细胞在骨折愈合不同时间点的神经型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶与内皮型一氧化氮合酶动态表达的生物学意义。方法:实验于1999-01/2004-02在中山大学动物试验中心、中山大学病理教研室完成、中山大学肿瘤防治中心完成。选择SD清洁级大鼠96只,按配对原则分为实验组48只,对照组48只;SD清洁级乳鼠20只进行成骨细胞原代培养。建立SD大鼠老龄骨质疏松骨折的动物模型,实验组将SD乳鼠颅骨体外培养的成骨细胞移植到SD雌性大鼠骨质疏松性骨折部位,对照组注入等量无血清培养液。手术后3,7,10,14,21,28,56,84d处死,每组每个时间点6只。用免疫组化检测骨折愈合不同时相的标本诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶和神经元型一氧化氮合酶的动态表达情况。结果:96只大鼠均进入结果分析。实验组:诱导型一氧化氮合酶在3d左右可见较多阳性表达的细胞,7d有表达高峰。内皮型一氧化氮合酶在3d左右可见少量阳性细胞,14d有表达高峰。神经元型一氧化氮合酶在10d左右可见少量阳性细胞,14～21d表达稍有增高,整个实验过程中神经元型一氧化氮合酶表达较弱,表达高峰不明显。而对照组诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶均有较弱表达,表达峰低平,而神经元型一氧化氮合酶表达很弱,未见明显表达高峰。结论:诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶在成骨细胞移植促进老年骨质疏松性骨折愈合的表达具有时效性,且表达的定位细胞不同,表达的量有差别,提示骨折部位一氧化氮合酶的释放可能对促进骨质疏松性骨折愈合有意义。神经元型一氧化氮合酶在成骨细胞移植促进老年骨质疏松性骨折愈合过程中的作用不明显。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

成骨细胞移植促进骨质疏松性骨折愈合的机制研究

背景：成骨细胞的同种异体移植，因其独特的优点，被认为是解决衰老骨重建修复较为理想的方法。目的：研究幼龄成骨细胞移植对促进SD老龄鼠骨质疏松性骨折愈合的作用机制。设计：配对设计的实验研究。地点和对象：本实验完成于中山大学动物试验中心及中山大学医学院病理教研室。SD清洁级大鼠，雌性，15-18月龄，体质量400～450g，96只；雄性，3～7d龄，SD清洁级乳鼠，20只，均由中山大学动物试验中心提供。干预：建立SD大鼠老龄骨质疏松骨折的动物模型，分为两组，每组48只。实验组将sD雄性乳鼠颅骨体外培养的成骨细胞移植到SD雌性鼠骨质疏松性骨折部位。对照组注入无血清培养液。手术后3，7，10，14，21，28，56，84d处死，用X射线、原位杂交、免疫组化及图像分析检测骨折愈合不同时相的标本。主要观察指标：①用X射线及病理切片观察试验组与对照组骨折愈合情况。②在骨折不同阶段，地高辛标记鼠Y染色体探针的阳性表达特点，以雄性Y染色体为标志，追踪移植细胞的远期存活及转归。③VEGF，TGF-β1及VEGF mRNA，TGF-β1 mRNA的动态表达。结果：实验组骨质疏松性骨折愈合的速度及程度均高于对照组；实验组：成骨细胞移植后可在受体骨折部位局部生存，生长繁殖，促进骨质疏松性骨折愈合，并于移植84d后仍存活。实验组VEGF，VEGFmRNA在7d左右可见有阳性表达的细胞，14d有分泌高峰，其中以软骨细胞中阳性最强，21d分泌量开始下降，56d后基本消失。TGF-β1，TGF-β1 mRNA在3d左右可见阳性细胞，7～10d有分泌高峰，其中以成纤维细胞、软骨细胞中阳性最强，14d分泌量开始下降，56d后完全消失。而对照组未见明显分泌高峰。结论：同种异体成骨细胞移植到老年大鼠骨质疏松性骨折部位，参与骨折修复的各个环节，可至少存活84d。TGF-β1，VEGF的动态表达对促进老年骨质疏松性骨折愈合具有重要意义。     

Notch信号通路在肿瘤中的研究进展

【摘要】 Notch信号通路是一条影响细胞命运、保守而重要的信号转导通路,几乎涉及所有细胞的生长活动,在调节细胞分化、增殖和凋亡,及在一系列生理、病理过程中都起着关键性的作用,并在肿瘤的发生、发展中也发挥了至关重要的作用。近年对Notch信号通路的研究不断加深和完善,使其与肿瘤的密切关系得到了充分呈现,并有望针对相关靶点设计靶向药物,为肿瘤治疗提供新方向。     

原代培养乳鼠窦房结细胞的形态和kir2.1蛋白表达

目的 研究乳鼠窦房结细胞中kir2.1蛋白表达水平,建立一套可靠的乳鼠窦房结定位、细胞培养与鉴定技术,为进一步心脏生物起搏实验奠定基础.方法 在石蜡切片中用HE染色、嗜银染色、髓鞘染色和Mallory磷钨酸-苏木素染色法(PTAH)进行乳鼠窦房结定位和形态学观察;取SD乳鼠的窦房结组织进行原代细胞培养,观察培养细胞的形态和搏动频率,免疫组织化学检测其kir2.1蛋白表达.结果 综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色3种方法可准确定位乳鼠窦房结组织.在培养的窦房结细胞中观察到梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞3种有自发性收缩的细胞,其中梭形细胞最多且形态结构特点和搏动频率符合起搏细胞的特点,三角形和不规则细胞与心房肌细胞特征相似.乳鼠窦房结细胞的kir2.1蛋白表达低于心房和心室肌细胞.结论 综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色3种方法可以准确定位SD乳鼠窦房结,乳鼠窦房结细胞中kir2.1蛋白表达水平低于心房和心室肌细胞.     

腹部手术术后胃排空障碍的诊断与治疗

目的：探讨腹部手术术后胃排空障碍的病因及诊断和治疗的有效方法。方法：我院2003年2月～2009年2月收治的腹部手术患者182例,对其临床诊治资料进行回顾性分析。结果：本组182例腹部手术患者中,19例术后确诊为胃排空障碍（3.94%）,19例经治疗后,除1例死于术后肺部感染外,其他患者均经非手术治疗,10～28d后出院。结论：腹部手术术后胃排空障碍早期诊断和治疗具有重要的临床意义,该病经胃镜和临床表现可明确诊断,药物和理疗效果较好。     

黄芪发酵产物对肺损伤大鼠TLR4-Src-NFκB-ICAM-1通路的影响

目的探讨黄芪发酵产物减轻PM2.5诱导炎症反应肺损伤的影响。方法 60只Wistar大鼠随机分成空白对照组、模型对照组、富马酸福莫特罗片对照组、黄芪发酵产物的低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只,根据文献采用气管滴注方法复制PM2.5肺损伤的动物模型,各组进行相应的处理4周,最后一次滴注24～36 h内处死,检测血清和右肺上叶组织匀浆中TNF-α、IL-6、IL-1的含量,进行右肺中叶的病理切片观察,使用胞核蛋白提取试剂盒提取左肺组织中的蛋白,将TLR₄、Src、p-Src、NF_κB、ICAM-1的条带通过β-actin进行归一化,并用图像分析软件进行半定量分析。结果黄芪发酵产物高剂量组与模型组比较,血清中的TNF-α、IL-1和右肺上叶组织匀浆中的TNF-α、IL-6、IL-1及左肺组织匀浆中的TLR₄、Src、NF_κB、ICAM-1均有统计学意义（P<0.01）,中剂量组与模型组比较,有些指标也有统计学意义,如Src、NF_κB、ICAM-1等。结论黄芪发酵产物在一...     

肺腺癌A549细胞CD133~+CD44~+表型在裸鼠体内成瘤能力的研究

目的 探讨肿瘤标志物CD133和CD44的表达与人肺腺癌A549细胞株在裸鼠体内形成肿瘤能力的关系.方法 使用单细胞克隆的方法 ,筛选出能够持续增殖分裂的肿瘤细胞,应用免疫荧光方法 和流式细胞仪检测CD133和CD44在具有增殖分裂能力的A549细胞和普通A549肿瘤细胞的表达情况;按表达结果 对A549细胞进行分组,应用单克隆方法 对各组细胞进行培养,并按不间密度注射于裸鼠皮下,观察各个组别的成瘤能力.结果 (1)在倒置显微镜下观察肿瘤细胞生长情况,发现多数细胞死亡,1周后仅有4.11%的细胞能够增殖分裂形成克隆.(2)具有增殖分裂能力肿瘤细胞的免疫荧光结果 :CD133阳性率为19.0%,CD44阳性率为57.0%;普通A549肿瘤细胞免疫荧光结果 :CD133阳性率为2.5%,CD44阳性率为34.0%;具有分裂增殖能力的肿瘤细胞CD133和CD44阳性表达率显著高于普通A549肿瘤细胞(P<0.01).(3)裸鼠体内成瘤能力实验提示:CD133~+CD44~+(A组)细胞成瘤能力显著高于CD133~-CD44~-(B组)、CD133~-CD44~+(C组)和CD133~+CD44~-(D组)细胞(P<0.05);裸鼠瘤块病理检查证实均为腺癌,各脏器检查未发现转移:在接种CD133~+CD44~+(A组)细胞的瘤块组织中发现除了有CD133~+CD44~+细胞外,还有CD133~-CD44~-细胞.结论 肺腺癌A549细胞株中CD133~+CD44~+细胞在裸鼠体内的成瘤能力显著高于其他细胞.     

活检印片应用AgNORs技术减少鼻咽癌误诊的意义

目的 :收集 1998- 0 6 / 1999- 10本院 10 0例鼻咽癌活检组织印片 ,探讨提高鼻咽癌细胞学诊断方法。方法 :应用鼻咽癌活检组织印片及 Ag NORs染色技术 ,显微镜观察结果。结果 :男 80例 ,女 2 0例 ,男∶女 =4∶ 1,男最大 70岁 ,最小 2 3岁 ,高峰年龄 30岁～ 5 0岁。患者 93%鼻咽有病灶 ,80 %颈淋巴结肿大。活检印片 HE常规制片 ,可疑者加 Ag NORs胶银染色可鉴别诊断。检查结果 97%找到癌细胞。 3例阴性者核对 HE切片亦为阴性。HE切片检查 91%确诊为鼻咽低分化鳞癌 ,1例诊为恶性淋巴瘤 ;6例为慢性鼻咽炎 ,1例报告坏死物及血性炎症分泌物。另 1例报告坏死物及肉芽组织增生。结论 :文中提出印片技术优点是经济省时 ,设备简单 ,便于基层医院推广应用 ,可减少鼻咽癌患者误诊率。     

停跳或不停跳心脏手术对血清 S-100B蛋白表达的影响

【目的】研究心脏手术围术期血清S-100B蛋白表达及其与停跳或不停跳心肺转流方式和时间的关系。【方法】体外循环心脏手术患者23例,测转流前、转流10min、转流末、转流后24h的血清S-100B蛋白表达水平。【结果】①血清S-100B蛋白质量浓度在体外循环前后动态变化:转流前(M)为0.27μg/L,转流10min后升至0.57μg/L(P<0.01),转流末达峰值1.80μg/L(P<0.01),转流后24h降为0.22μg/L(P>0.05)。转流末的血清S-100B蛋白质量浓度与转流时间呈正相关(r=0.488,P<0.05)。②停跳组(n=6)转流前、转流10min、转流末、转流后24h平均血清S-100B蛋白质量浓度分别为(0.17±0.09)μg/L、(0.48±0.13)μg/L、(1.65±0.52)μg/L和(0.19±0.04)μg/L,不停跳组(n=6)分别为(0.26±0.14)μg/L、(0.71±0.41)μg/L、(1.59±0.84)μg/L和(0.23±0.11)μg/L,两组差别无统计学意义(P>0.05)。【结论】体外循环可导致血清S-100B蛋白表达增高,其表达水平与心肺转流时间呈正相关,但与停跳或不停跳转流方式无关。