颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究

托品烷类生物碱（tropane alkaloids,TAs）是临床上广泛使用的抗胆碱药物,颠茄是药典收录的TAs最主要的商业栽培药源植物。基于颠茄转录组测序数据构建TAs合成途径中9个结构基因（ODC,ADC,AIH,CPA,SPDS,PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ）UniGene序列的数字表达谱,采用qPCR对其中4个已报道基因（PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ）的表达水平进行验证分析,同时采用HPLC测定不同组织中TAs含量。数字表达谱分析结果表明4个TAs上游合成途径基因（ODC,ADC,AIH,CPA）和2个支路途径基因（SPDS,TRⅡ）在颠茄各器官中均有表达,但在须根中高水平表达;3个TAs合成途径特异的结构基因PMT,CYP80F1和H6H均只在须根中大量表达,主根中其次。qPCR检测PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ的表达结果与数字表达谱基本一致,但PMT,CYP80F1,H6H在主根中表达量很低。莨菪碱质量分数在嫩茎中最高（3.364 mg·g^-1）,幼叶,根,幼果和果萼中其次（分别为1.526,1.598,1.271,1.413 mg·g^-1）;东莨菪碱质量分数在果萼中最高（1.003 mg·g^-1）,嫩茎和幼叶（分别为0.600,0.601 mg·g^-1）中其次;2种生物碱在老茎（莨菪碱0.283 mg·g^-1,东莨菪碱0.043 mg·g^-1）和老叶（莨菪碱0.313 mg·g^-1,东莨菪碱0.080 mg·g^-1）中质量分数均为最低。该研究结果表明须根是颠茄TAs 生物合成主要器官,而地上幼嫩组织是TAs主要存贮积累器官,TAs合成后存在转运过程。PMT下游基因均只在须根中表达,筛选颠茄须根的转录组数据库就可能为解决该途径中不清晰的合成步骤和相关转录调控因子提供有力的帮助。     

酵母提取物对颠茄毛状根氮代谢及次生代谢影响的机制探究

以颠茄毛状根为试验材料,向培养基中添加酵母提取物(yeast extract,YE),测定颠茄毛状根氮代谢关键酶的活性,各形态氮的含量,次生代谢前体物质含量,次生代谢途径中关键酶基因相对表达量以及主要托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)莨菪碱和东莨菪碱的产量,初步探究YE诱导合成颠茄毛状根次生代谢产物的机制。结果表明:较对照组而言,氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著升高,谷氨酸脱氢酶(GDH)活性变化不显著。硝态氮,铵态氮含量显著下降,而可溶性蛋白,游离氨基酸,总氮含量均显著升高。此外,YE处理颠茄毛状根提高了次生代谢途径中的前体氨基酸(鸟氨酸和精氨酸)的含量以及代谢前体腐胺的含量,3个关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶基因(putrescine N-methyl transferase,pmt)、托品酮还原酶-Ⅰ基因(tropinone reductase-Ⅰ,tr I)和莨菪碱6-β-羟化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydroxylase,h6h)的相对表达量也呈现不同幅度的上升,最终导致莨菪碱和东莨菪碱产量的增多,在处理16 d后分别是对照组的3.09,1.85倍。这说明YE诱导氮代谢关键酶活性升高使氮代谢加速,为次生代谢中含氮化合物的合成提供更多原料,同时通过调控次生代谢途径中关键酶基因的表达,使莨菪碱和东莨菪碱产量提高。     

茉莉酸甲酯对颠茄托品烷类生物碱代谢及相关基因表达的影响

莨菪碱和东莨菪碱是颠茄中重要的托品烷类生物碱次生代谢产物,具有多方面药理价值。该研究采用土培法种植颠茄实生苗,设置不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)处理,分析不同浓度MeJA对颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量、生物碱合成的上游物质以及关键酶基因表达量的影响。结果表明,MeJA浓度为200μmol·L-1时更有利于颠茄生物碱的积累;对腐胺(Put)及其合成的关键酶活性的测定发现,Put的含量与其合成的关键酶活性的变化基本一致,都随MeJA浓度升高先增加后降低,Put含量在MeJA浓度为200μmol·L-1时达到最高;对PMT,TRⅠ,H6H表达量的检测发现,200μmol·L-1MeJA处理下叶片和根部TRⅠ,H6H基因均有较高的表达水平,PMT基因表达量无明显变化趋势。以上结果说明,MeJA对颠茄莨菪碱和东莨菪碱合成的调控主要依靠影响关键酶基因的表达量发挥效用,适宜浓度茉莉酸甲酯提高了颠茄叶片TRⅠ和根部TRⅠ与H6H表达量,从而促进莨菪碱的合成和莨菪碱向东莨菪碱的转化,提高颠茄体内莨菪碱和东莨菪碱的积累。     

干旱胁迫及施加氮素对长春花生物碱的调控

目的:为了阐明不同的干旱条件及氮素水平对长春花叶片中4种生物碱(文多灵、长春质碱、长春碱、长春新碱)含量的影响,为提高长春花生物碱含量提供理论指导。方法:实验设置了CK(对照组即自然生长)、CN(对照+施氮素)、LK(轻度干旱)、LN(轻度干旱+施氮素)、HK(重度干旱)、HN(重度干旱+施氮素)6个处理组,探讨各处理组条件下长春花叶片全氮含量、碱性POD活性、TDC活性、4种生物碱含量的变化特性。结果:轻度干旱条件下POD,TDC的酶活性在处理的整个时期均提高,且胁迫的早期(0～21 d),有利于文多灵、长春质碱、长春碱、长春新碱的积累,后期(28～35 d)反而起抑制作用4种生物碱含量降低。施加外源氮素能有效提高各组长春花叶片中全氮含量、POD和TDC酶活性、文多灵和长春质碱的含量,干旱+施加氮素(LN,HN)处理下有利于长春碱和长春新碱的积累。结论:干旱胁迫及施加氮素对长春花叶片中POD,TDC的活性及4种生物碱的含量均能产生影响,轻度干旱条件下施加氮素(LN)对文多灵、长春质碱、长春碱、长春新碱含量的提高最为显著,是通过全氮含量及酶活性提高来调控的。     

增强UV-B对黄连代谢及小檗碱含量的影响

目的:测定黄连根中小檗碱含量对不同UV-B辐射强度的响应,为提高黄连小檗碱含量提供理论参考.方法:实验设置了CK(自然光),UL(0.05 W·m-2),UM(0.10 W·m-2),UH(0.20 W·m-2)4个处理组,探讨UV-B辐射下初生代谢中光合特性、PPP途径和次生代谢中酪氨酸酶及黄连根中的小檗碱含量的变化特性.结果:在UH辐射胁迫下,黄连叶片中光合色素、PSⅡ非光化学猝灭系数(qN),初始荧光(Fo),电子传递速率(ETR)以及6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性、根中小檗碱含量均较其他组低.而处于UM辐射下的黄连,光合作用能力、PPP途径、酪氨酸酶活性以及小檗碱含量均高于对照组,产生了胁迫应激反应来抵御适度的UV-B辐射.结论:黄连处于UM辐射时,通过增强光合作用及PPP途径,能提供较多的次生代谢物前体物及次生代谢物所必需的NADPH,进而小檗碱的含量也相应提高,为黄连栽培种植中提高小檗碱含量提供参考.     

短期干旱对黄连叶片光合作用限制因素的研究

目的 探讨短期干旱对黄连叶片光合作用的限制因素,为黄连栽培中抗旱研究提供科学依据。方法 通过测定土壤相对含水量,设置了CK（正常水分）、LD（轻度干旱）、MD（中度干旱）、HD（重度干旱）4个处理组,测定了短期干旱下黄连叶片快速光响应曲线,气孔导度（Cond）、蒸腾速率（Tr）、胞间二氧化碳（Ci）随光强变化特性。结果 随着光合有效辐射（PAR）强度的增加,LD、MD、HD组的最大荧光产量（Fm’）下降幅度,非光化学猝灭系数（qN值）的上升幅度均低于CK组,且HD组Fm’下降幅度最低为54.2%,qN值最低为0.595。相反,LD、MD、HD组Ft值上升幅度,qN、有效荧光产量（φPSII）的下降幅度均高于CK组,此外CK组的Cond和Tr高于LD、MD组,但低于HD组,且Ci也低于HD组。结论 短期重度干旱胁迫对黄连叶片光合作用的限制主要是非气孔因素起主导作用（PSII反应中心失活,热耗散能力降低,电子传递速率降低等）;短期轻度、中度干旱胁迫对黄连叶片光合作用的限制是非气孔因素和气孔因素共同作用。     

增强UV-B辐射对胡椒薄荷叶片光合机构和光合特性的影响

目的:为了阐明紫外辐射胁迫对药用植物胡椒薄荷生长发育的影响,模拟大气中紫外辐射增强的情况,考查了不同强度UV-B辐射胁迫对胡椒薄荷的光合作用的影响.方法:实验设置了自然光对照(0 W·m~(-2)),轻度UV-B辐射胁迫(0.15 W·m~(-2))和重度辐射胁迫(0.35 W·m~(-2))3个不同处理组,探讨了不同强度UV-B辐射对胡椒薄荷叶绿体超微结构、光合作用和叶绿素荧光参数的影响.结果:在轻度UV-B辐射胁迫下,胡椒薄荷叶绿体超微结构虽然受到了一定程度的破坏,但处理过程中,F_v/F_m,F_v/F_o,qP,ΦPSⅡ和ETR在一段时间内降低后仍能恢复到和自然光对照相当的水平,qN表现出先升高后降低的趋势,而处于重度UV-B辐射胁迫下的胡椒薄荷,由于其光合机构受到严重破坏,通过自身保护机制已不能恢复到相应水平.结论:胡椒薄荷处于轻度UV-B辐射胁迫时,光合能力虽然在一定程度上有所降低,但是可以通过较强的热耗散来保护光合机构.研究证实胡椒薄荷对轻度紫外辐射胁迫有良好的适应能力,可在紫外辐射偏强的地方广泛种植,具有一定的经济效应.     

外源Ca2+对高温胁迫下半夏光合参数及有效成分积累的影响

目的：研究叶喷施钙盐对高温胁迫下半夏的光合参数及3种有效成分积累的影响。方法：待半夏株高10 cm左右时,高温处理并喷施不同浓度的CaCl₂溶液,18 d后测定半夏叶片叶绿素含量、光合作用参数及叶绿素荧光参数,并测定了块茎中鸟苷、腺苷及多糖的含量。结果：与对照相比,喷施Ca²⁺明显提高了叶绿素含量和叶绿素a/b;6 mmol·L^-1Ca²⁺处理显著提高了叶片的净光合速率（P_n）、蒸腾作用（T_r）和气孔限制值（L_s）,降低了胞间CO₂浓度（C_i）;随Ca²⁺浓度的升高,叶片最大光能转换效率（F_v/F_m）、实际光合效率（Yield）和光化学猝灭系数（qP）呈先升后降的趋势,初始荧光（F_o）及非光化学猝灭系数（NPQ）呈先降后升趋势;半夏块茎的干重及其中的鸟苷、多糖含量随Ca²⁺浓度的升高呈现先升后降趋势,腺苷含量则随之升高而升高;当Ca²⁺浓度为6 mmol·L^-1时,块茎的干重、鸟苷及多糖含量最高。结论：叶面喷钙缓解了高温对半夏叶片光合作用的抑制以及对PSⅡ系统的损伤,从而提高半夏的产量。     

过表达莨菪h6h基因提高颠茄东莨菪碱含量的研究

文章采用代谢工程方法培育东莨菪碱高产转基因颠茄.根癌农杆菌遗传转化颠茄,过量表达东莨菪碱合成途径中限速酶基因h6h(Hnh6h),卡那霉素筛选获得转基因植株,快繁炼苗后,田间栽培至果期.基因组PCR鉴定转Hnh6h基因颠茄.SPSS软件分析转基因与非转基因颠茄株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等性状的差异;HPLC测定其根、茎、叶、果中莨菪碱及东莨菪碱含量;采用qPCR技术测定各组织Hnh6h基因表达量.结果所获得的5个转基因颠茄株系(A8,All,A12,C8,C19)都能同时检测到Kanr和Hnh6h基因,在非转基因颠茄中没有检测到这2个基因;与非转基因颠茄比较,转基因颠茄株系的株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等都没有降低,且部分性状优于对照.转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量最高,且高于莨菪碱;不同转基因颠茄株系叶片中东莨菪碱含量依次为C8 ＞A12 ＞C19 ＞All ＞A8,C8的东莨菪碱质量分数(2.17 mg·g-l DW)比非转基因颠茄(0.42 mg·g-1 DW)提高4.2倍;在转基因颠茄根、茎、叶和果中都检测到Hnh6h基因表达,且在叶片中表达量最高,非转基因颠茄没有检测到Hnh6h基因表达.因此,过表达Hnh6h基因能够打破颠茄的东莨菪碱生物合成的限速反应,从而推动代谢流向东莨菪碱合成方向流动,提高了东莨菪碱合成能力,最终获得了东莨菪碱高含量的转基因颠茄.     

短期干旱对黄连叶片光合作用限制因素的研究

目的探讨短期干旱对黄连叶片光合作用的限制因素,为黄连栽培中抗旱研究提供科学依据。方法通过测定土壤相对含水量,设置了CK(正常水分)、LD(轻度干旱)、MD(中度干旱)、HD(重度干旱)4个处理组,测定了短期干旱下黄连叶片快速光响应曲线,气孔导度(Cond)、蒸腾速率(Tr)、胞间二氧化碳(Ci)随光强变化特性。结果随着光合有效辐射(PAR)强度的增加,LD、MD、HD组的最大荧光产量(Fm’)下降幅度,非光化学猝灭系数(qN值)的上升幅度均低于CK组,且HD组Fm’下降幅度最低为54.2%,qN值最低为0.595。相反,LD、MD、HD组Ft值上升幅度,qN、有效荧光产量(φPSII)的下降幅度均高于CK组,此外CK组的Cond和Tr高于LD、MD组,但低于HD组,且Ci也低于HD组。结论短期重度干旱胁迫对黄连叶片光合作用的限制主要是非气孔因素起主导作用(PSII反应中心失活,热耗散能力降低,电子传递速率降低等);短期轻度、中度干旱胁迫对黄连叶片光合作用的限制是非气孔因素和气孔因素共同作用。