携带小鼠白细胞介素-12基因的增殖型腺病毒对胃癌细胞的作用

目的观察携带小鼠白细胞介素12(mIL12)基因的增殖型腺病毒载体对胃癌细胞的杀伤作用及mIL12表达情况。方法以携带目的基因的增殖型腺病毒CNHK200mIL12感染人胃癌细胞株SGC7901、人正常肝细胞株L02。首先,通过荧光显微镜下观察、细胞杀伤实验等观察病毒对细胞的杀伤能力;其次,通过Westernblot分析及双抗体夹心法(ELISA)检测mIL12表达情况。结果CNHK200mIL12感染SGC7901后,当MOI=10时即可杀伤大部分的肿瘤细胞,与ONYX015相当,而对正常细胞无明显杀伤。ELISA检测表明mIL12基因表达量达(267.2±34.6)ng/5×105个细胞/48h,较复制缺陷型腺病毒载体高近百倍。结论CNHK200mIL12能在胃癌细胞中复制及增殖杀死胃癌细胞,并高水平表达目的基因。     

PBX1基因对系统性红斑狼疮易感基因IFI16表达的影响

探讨PBX1基因转染人单核细胞系THP1后,对IFI16基因表达的影响。以携带人PBX1基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(pDC315-PBX1-EGFP)转染THP1细胞后,采用实时定量PCR(RT-PCR)和Western blot技术分别在mRNA水平和蛋白水平检测PBX1和IFI16表达的变化。结果,pDC315-PBX1-EGFP转染THP1细胞后,PBX1基因的表达水平都增高,同时发现IFI16基因的表达水平降低。PBX1作为一种转录因子,能调节干扰素诱导蛋白IFI16的表达。     

腺病毒介导的小鼠内皮抑素治疗胃癌的研究

目的:探讨人血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)对人脐静脉内皮细胞(human umbilican vein endothelia cell,HUVEC)增殖和凋亡的影响,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制.方法:构建pcDNA3.1-V5-HisC-Ang-1真核表达载体,并瞬时转染293细胞;取新生儿脐带经胶原酶消化等方法分离培养HUVEC;分别通过MTT比色和细胞计数法,分析Ang-1瞬时转染上清对HUVEC增殖的影响;通过流式细胞仪分析在血浆饥饿实验条件下,Ang-1对HUVEC凋亡的影响.结果:成功克隆了Ang-1基因,构建了其正义真核表达载体,并在293细胞中瞬时表达;成功进行了HUVEC的原代分离及传代培养;MTT法检测HUVEC增殖结果:只加培养液组、加空载体转染上清组、加Ang-1转染上清组HUVEC OD490值分别为0.36±0.11,0.40±0.03,0.68±0.10(P＜0.05);细胞计数法检测结果依次为:(10.13±2.06)×104,(8.7±1.73)×104,(15.03±1.98)×104(P＜0.05).流式细胞仪检测HUVEC凋亡率依次为:21%,19%和6%.结论:Ang-1能显著促进血管内皮细胞体外增殖,抑制血浆饥饿时HUVEC的凋亡.     

特异性增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外肿瘤杀伤实验

目的:构建增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ和增殖缺陷型腺病毒AdEasy-mIFN-γ,比较两者在肿瘤细胞中表达mIFN-γ蛋白的能力以及CNHK200-mIFN-γ,ONYX-015及野生型腺病毒Ad5在正常及肿瘤细胞中的增殖力,进一步观察其抗瘤效果.方法:以病毒增殖试验检测病毒在细胞中的增殖能力;透射电镜观察CNHK200-mIFN-γ在Hep3B细胞中的增殖复制;检测病毒感染肿瘤细胞后mIFN-γ的表达;CPE实验观察增殖病毒对细胞的杀伤效应.结果:CNHK200-mIFN-γ和ONYX-015仅在肿瘤细胞中增殖,且前者增殖力较强.CNHK200-mIFN-γ在肿瘤细胞中表达mIFN-γ,且表达量与病毒增殖密切相关,而AdEasymIFN-γ在肿瘤细胞中的mIFN-γ表达几乎不能测到.ONYX-015与CNHK200-mIFN-γ对正常的细胞无杀伤性,但能有效地杀伤癌细胞.结论:外源基因mIFN-γ的插人没有改变增殖病毒在肿瘤细胞中选择性增殖的特性.增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ具有良好的肿瘤选择性及增殖性,且可以有效表达mIFN-γ,并且有效杀伤癌细胞,显示其良好的临床应用前景.     

腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用

目的:以增殖缺陷型腺病毒载体介导p16基因感染人肺腺癌细胞系,观察并鉴定该基因在细胞中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响.方法:采用293细胞内同源重组的方法,制备重组腺病毒Ad5-p16,感染肺腺癌细胞SPC-A1;免疫组化方法鉴定P16蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果:以M0I=10的重组增殖缺陷型腺病毒Ad5-p16感染SPC-A1细胞48 h后,P16蛋白表达的阳性细胞比率为71%;以MOI=100感染SPC-A1细胞后第2天,细胞开始出现生长抑制及细胞病变;FCM分析发现细胞在感染腺病毒后出现细胞周期阻滞和细胞凋亡.结论:以腺病毒为载体介导p16基因在SPC-A1细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡的作用.本项基因治疗策略以直接调控细胞周期的抑癌基因为靶向治疗基因,为肺癌基因治疗提供了可靠的理论依据.     

肿瘤端粒酶靶向腺病毒载体的表达活性

目的　构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体 ,研究其介导目的基因在肿瘤细胞内的定向表达能力。方法　将端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子克隆入质粒 pDC3 12的多克隆位点构成外源基因表达盒 ,在基因表达盒上下游分别插入 1个绝缘子序列 ,构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体pSG TPE ;采用Luciferase报告基因进行hTERT启动子的活性分析 ;以pSG TPE携带绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因 ,重组腺病毒AdTPE EGFP ,观察其介导EGFP在肿瘤细胞内的定向表达能力 ,并与CMV启动子控制的腺病毒AdCMV EGFP作对照。结果　hTERT启动子在正常细胞内几乎没有活性 ,而在肿瘤细胞内的活性与SV 40启动子相近。腺病毒AdTPE EGFP能介导EGFP在肿瘤细胞内定向而稳定表达 ,在正常细胞内不表达 ,而对照腺病毒AdCMV EGFP在肿瘤和正常细胞内均表达EGFP。结论　靶向端粒酶阳性肿瘤的腺病毒载体 pSG TPE ,不但提高了对基因表达调控的特异性 ,而且降低了对正常细胞毒性作用。绝缘子的应用隔断了外源基因表达盒和病毒基因表达调控序列之间的互相干扰 ,进一步提高目的基因的表达效率。该载体对肿瘤的靶向基因治疗具有重要的应用价值。     

一种新型增殖型腺病毒治疗肝癌的体外研究

目的评价增殖腺病毒 CNHK500对肝癌细胞的治疗效果。方法利用病毒增殖实验、细胞活力实验(MTT)、蛋白印迹分析来检测增殖病毒 CNHK500在端粒酶阳性的肝癌细胞株 HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721及正常细胞中选择性增殖和溶解细胞的特性。结果 CNHK500感染人肝癌细胞株 HepGⅡ、Hep3B、SMMC7721细胞后大量增殖,在感染后96小时增殖倍数分别为52000、396984.9和632911.3倍,同野生型5型腺病毒(wtAd5)类似。然而在正常细胞中,CNHK500的增殖能力较 wtAd5大大减弱,感染96小时后仅增殖3.1～100倍,而 wtAd5却高达3160～17357倍。MTT 实验观察到在肝癌细胞 HepGⅡ和 Hep3B 中,感染后第7天达到半数杀伤的 MOI 值(IC50)分别为2和0.01,而在正常成纤维细胞 BJ 细胞中却高达1000。在常氧情况下,用蛋白印迹可在肿瘤细胞中检测到腺病毒 E1A 蛋白的表达,但在正常细胞却检测不到。E1B 蛋白仅在缺氧条件下(0.1%O_2)的肿瘤细胞中表达。结论实验结果表明 CNHK500能有效地选择性在肝癌细胞中增殖、复制、杀伤,而在正常细胞中增殖和溶解细胞能力却大大减弱。联合治疗基因,CNHK500可能为肝癌的治疗提供一种新的策略。     

DETECTION OF HUMAN TELOMERASE ACTIVITY BY TELOMERASE TRAP-ELISA ASSAY

ＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＵＭＡＮＴＥＬＯＭＥＲＡＳＥＡＣＴＩＶＩＴＹＢＹＴＥＬＯＭＥＲＡＳＥＴＲＡＰ—ＥＬＩＳＡＡＳＳＡＹＷｅｉＬｉｘｉｎ卫立辛ＷｕＭｅｎｇｃｈａｏ吴孟超ＹａｎＺｈｅｎｌｉｎ阎振林ＳｈｅｎＦｅｎｇ沈锋ＸｉｅＴｉａｎｐｅｉ谢天培Ｑｉａ...     

增殖性腺病毒CNHK600-p53的构建及对胰腺癌细胞抑制的体外实验研究

目的 探讨携带p53基因的新型增殖性腺病毒CNHK600-p53的导入能否增加胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,观察化疗药物5-FU、丝裂霉素(MMC) 和表阿霉素(epirubicin, EPI)单独应用及与CNHK600-p53联合应用对胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应.结果 PANC1在5-FU浓度为400 μg/ml时细胞抑制率为(65±4.2)%,MMC浓度为1 μg/ml时细胞抑制率为(41±1.9)%,EPI浓度为10 μg/ml时细胞抑制率为(65±1.8)%.转入CNHK600-p53(MOI = 0.625)后再使用上述浓度的化疗药物,PANC1的细胞抑制率分别为(89±5.3)%、(60±2.3)%和(75±1.5)%.当MOI值为0.3125、0.625、1.25时,CNHK600-p53组和Ad-p53组的细胞抑制率分别为(27±2.5)%、(30±3.7)%、(61±4.3)%和(4±2.7)%、(5±3.5)%、(16±4.5)%.结论 单用CNHK600-p53效果优于Ad-p53,携带p53基因的CNHK600-p53能提高胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性.     

乙肝肝硬化并发皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤伴噬血细胞综合征的治疗分析

目的 探讨乙肝肝硬化并发皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(SPTCL)伴噬血细胞综合征(HPS)的临床特征和治疗方法。 方法 回顾性分析2014年8月第二军医大学附属东方肝胆外科医院1例乙肝肝硬化并发SPTCL伴HPS病例的临床资料。 结果 T细胞受体(TCR)表型不同则该病的侵袭性、治疗反应性及预后明显不同,伴HPS者治疗效果不佳,生存期短。 结论 乙肝肝硬化并发SPTCL伴HPS罕见,早期骨髓形态学、病理学、免疫组化及基因重排检测对确诊有重要意义,及早有效控制乙肝病毒尤为重要。早期诊断及治疗对延长患者生存期有重要意义。