补肾化痰方对去势骨质疏松模型大鼠Th17/Treg平衡机制的影响

目的 研究补肾化痰方在防治绝经后骨质疏松症中对免疫T细胞亚群辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）平衡的影响。方法 6月龄SD雌性大鼠60只,按随机数字表分为假手术组,模型组,戊酸雌二醇组（0.184 mg·kg^-1）,补肾化痰方低、中、高剂量组（4.7,9.4,18.8 g·kg^-1）,除假手术组外,其他组均采用手术切除卵巢,制作绝经后骨质疏松症模型。术后1周灌胃给药,模型组和假手术组以等体积的生理盐水灌胃,1次/d,灌胃12周后取材。运用微计算机断层扫描技术（Micro CT）检测大鼠骨量及骨微结构;采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中叉头框蛋白p3（Foxp3）,维甲酸相关核孤受体γt（RORγt）含量;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测骨组织中Foxp3,RORγt mRNA表达,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测骨组织中Foxp3,RORγt蛋白表达量;运用流式细胞抗原检测,分析并比较各组Th17,Treg细胞的数量。结果 与假手术组比较,模型组大鼠骨量降低、骨小梁显著减少（P<0.01）;骨微结构破坏,血清中Foxp3浓度显著降低,RORγt浓度显著升高（P<0.01）,骨组织中Foxp3 mRNA及蛋白表达降低,RORγt mRNA及蛋白表达显著升高（P<0.01）,骨组织中Treg细胞数量减少（P<0.01）,Th17细胞数量增加,且Th17/Treg值显著升高（P<0.01）;与模型组比较,各给药组骨量明显增加（P<0.05,P<0.01）,血清中Foxp3浓度升高,RORγt浓度显著降低（P<0.01）,骨组织中Foxp3 mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.05,P<0.01）,但低剂量组mRNA差异无统计学意义,RORγt mRNA及蛋白表达明显降低（P<0.05,P<0.01）,骨组织中Treg细胞数明显升高,Th17细胞数量明显降低（P<0.05,P<0.01）,且Th17/Treg显著降低（P<0.01）。结论 补肾化痰方可以提高去卵巢大鼠骨量,改善骨微结构,并使骨组织中Treg细胞数量增加而Th17细胞数量减少。进而推论补肾化痰方可能通过调节Th17/Treg平衡,而发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。     

基于“肾痰”认识骨-脂代谢异常失衡在绝经后骨质疏松症发病中的作用

绝经后骨质疏松症（PMOP）是绝经后妇女常发生的一种全身性代谢疾病,主要表现为骨量低下、骨微结构退行性改变、骨脆性增加且极易发生脆性骨折,严重威胁着绝经后妇女的健康。现代研究表明绝经后骨代谢紊乱与脂代谢失衡常常并见,中医学则认为PMOP的发病多从肾论治。课题组长期从事PMOP的临床与基础研究工作,认为骨-脂代谢失衡是PMOP的重要发病机制,“肾痰”亦是PMOP发病的关键所在,临床论治除了补肾,还应化痰,并通过一系列实验研究证实了从“肾痰”论治PMOP的可能性。因此,本文拟基于“肾痰”探讨骨-脂代谢失衡在绝经后骨质疏松症发病中的作用,丰富中医药论治PMOP的科学内涵。     

补肾化痰方对OVX诱导的骨质疏松大鼠血清LPS及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的 研究补肾化痰方对双侧卵巢切除术（OVX）诱导的骨质疏松大鼠脂多糖（LPS）及Toll样受体4（TLR4）/髓样细胞分化蛋白88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响。方法 将60只SPF级6月龄的雌性大鼠随机分为假手术组,模型组,戊酸雌二醇组,补肾化痰方低、中、高剂量组,使用双侧OVX造模,造模后1周,每组中挑选8只,戊酸雌二醇组按0.184 mg·kg^-1,补肾化痰方低、中、高剂量组分别按4.7,9.4,18.8 g·kg^-1灌胃,假手术与模型组给予0.9%生理盐水4 mL灌胃,干预12周后处死取材。运用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清LPS含量,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测骨组织中TLR4,MyD88,磷酸化（p）-NF-κB p65的蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测骨组织中TLR4,MyD88,NF-κB p65 mRNA水平及通路相关炎症因子白细胞介素（IL）-1β,IL-6 mRNA的表达。结果 与假手术组比较,模型组的血清LPS水平,骨组织中TLR4,MyD88,p-NF-κB p65蛋白表达水平,TLR4,MyD88,NF-κB p65,IL-1β,IL-6 mRNA水平均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,戊酸雌二醇组和补肾化痰方高剂量组血清LPS水平,骨组织中TLR4,MyD88,p-NF-κB p65的蛋白表达,TLR4,MyD88,NF-κB p65 mRNA水平,以及下游炎症因子IL-1β,IL-6 mRNA水平有不同程度降低（P<0.05）。结论 补肾化痰方可以降低血清LPS含量,调控TLR4/MyD88/NF-κB通路中TLR4,MyD88,NF-κB p65,p-NF-κB p65的mRNA水平及蛋白表达,降低骨组织中IL-1β,IL-6 mRNA水平,改善骨微结构,抑制绝经后骨质疏松症的病情发展。     

补肾化痰方调控去势骨质疏松大鼠骨脂分化改善绝经后骨丢失的机制

目的 探讨补肾化痰方维持去势骨质疏松模型大鼠成骨/成脂分化平衡防治绝经后骨质疏松症（PMOP）的作用机制。方法 6月龄雌性未孕SD大鼠75只,随机分为假手术组、模型组、阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组,除假手术组外,其余4组大鼠均切除双侧卵巢,假手术组切除卵巢周围相应体积的脂肪组织。术后第5周起给予对应药物灌胃,剂量分别为补肾化痰组9.4 g·kg^-1、阿托伐他汀组0.92 mg·kg^-1、利维爱组0.23 mg·kg^-1,模型组和假手术组给予等容生理盐水,1次/d,持续8周。采用微计算机断层扫描技术（Micro CT）检测各组大鼠胫骨骨密度（BMD）,苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠骨髓脂肪组织（BMAT）相对面积,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测骨组织Runt相关转录因子2（Runx2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、瘦素（LPN）、瘦素受体（OBR）表达量。结果 与假手术组比较,模型组大鼠BMD明显下降（P<0.05）,BMAT相对面积明显升高（P<0.05）,LPN、OBR、Runx2表达明显下降（P<0.05）,PPARγ明显升高（P<0.05）。与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组BMD明显升高（P<0.05）,BMAT相对面积明显下降（P<0.05）,LPN、OBR、Runx2表达明显上升（P<0.05）,PPARγ明显下降（P<0.05）。结论 补肾化痰方可能通过上调骨组织中LPN及OBR的表达,维持去势骨质疏松大鼠的骨脂分化平衡,从而减少绝经后骨丢失,发挥防治PMOP的作用。     

补肾化痰方影响去势骨质疏松大鼠Leptin及β2-AR表达的实验研究

[目的]探讨补肾化痰方影响瘦素(Leptin)及β2肾上腺素能受体(β2-AR)的表达水平来防治绝经后骨质疏松症的机制。[方法]将75只大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾化痰组、利维爱组、阿托伐他汀组,采用双侧卵巢摘除建立去势骨质疏松模型,假手术组只切除卵巢周围同等质量的脂肪组织。使用微计算机断层扫描技术(Micro-CT)检测大鼠右侧股骨的骨密度(BMD),酶联免疫吸附(ELISA)检测大鼠血清Leptin、雌二醇(E2),全自动生化仪检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),聚合酶链反应(PCR)检测骨组织中Leptin mRNA、β2-AR mRNA相对表达量。[结果]模型组相对于假手术组BMD、血清Leptin、E2水平明显降低;治疗后,补肾化痰组相对于模型组的BMD、血清Leptin、E2、HDL-C含量及骨组织Leptin mRNA表达水平明显提高,血清TC、TG、LDL-L含量及骨组织β2-AR mRNA表达水平明显降低,与利维爱组及阿托伐他汀组比较无明显差异。[结论]补肾化痰方可以有效提高绝经后骨质疏松大鼠的BMD,补充雌激素水平,通过调节Leptin水平来介导交感神经的活性,起到防治绝经后骨质疏松和改善脂代谢的作用。     

赤芍抗凝血活性成分的筛选

目的 建立超滤质谱快速筛选赤芍活性成分的方法，从中得到可能的潜在抗凝血活性成分。方法 对赤芍不同极性部位成分进行鉴定，以凝血酶(thrombin, THR)为靶标，亲和超滤法逆靶向筛选赤芍中的凝血酶抑制剂，并对得到的活性成分进行分析、鉴定；采用生色底物法及体外抗凝法对其进行活性验证，通过分子对接对其结合能力进行初步分析。结果 经对赤芍不同极性部位成分进行定性分析，检测出17个成分，并通过亲和超滤质谱法筛选得到一个可能的抗凝血活性成分——鞣花酸。鞣花酸浓度为1 g·L^-1时对凝血酶百分抑制率可达98.34%;体外凝血实验发现鞣花酸凝血酶时间(thrombin time, TT)与空白组相比有显著性差别(P<0.01),表明其为潜在的凝血酶直接抑制剂；分子对接结果显示鞣花酸与凝血酶活性结合位点多、结合能低，具有良好的结合效果。结论 建立了一种快速筛选赤芍中抗凝血活性成分的方法，筛选结果表明鞣花酸可能为潜在的凝血酶抑制剂，为中药的靶向治疗、机制探索和质量控制提供了有价值的参考。