基因疫苗pcDNA-AChRα211免疫小鼠建立重症肌无力动物模型

目的：用基因疫苗pcDNA-AChRα211，免疫C57BL／6小鼠建立实验性自身免疫性重症肌无力模型（EAMG）。方法：将人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要免疫区（AChRα211）的基因片段插入到穿梭载体pcDNA3．0中，构建基因疫苗pcDNA-AChRα211。大量提纯质粒pcDNA-AChRα211后肌肉注射C57BL／6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChRα211，的IgG（ACh-RAb），并用PCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况。结果：双酶切鉴定和序列测定表明构建了含正确目的基因阅读框的重组质粒pcDNA-AChRα211，ELISA分析表明该基因疫苗免疫的C57BL／6小鼠血清中含有AChRAb，且免疫三个月后在小鼠的肌肉、肝、脾、肾中仍可检测到目的基因AChRα211的存在。结论：重组质粒pcDNA-AChRα211作为基因疫苗能够诱导实验性自身免疫性重症肌无力。     

人β-防御素DEFB113的重组表达及活性鉴定

DEFB113为人β-防御素家族新成员,其生物学功能尚不清楚。为了探索一种可以较低成本和较高产量表达活性DEFB113多肽的方法,将编码DEFB113成熟肽的序列克隆到载体pTWIN1上,并转化至E.coliBL21(DE3)中进行表达。结果表明融合蛋白主要以可溶形式存在;重组载体中融合标签的几丁质结合域(CBD)和内含肽(intein)分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成。最终得到DEFB113多肽的产率为6～7 mg/LLB。经活性鉴定,该重组DEFB113多肽对于S.aureus,E.coli K12D31和C.albicans均表现出较强的抑制作用;另外DEFB113无明显的溶血活性,是一种较理想的多肽抗生素。该研究为进一步研究DEFB113的生理功能以及其它人β-防御素结构与功能奠定了基础。     

细胞毒素Gelonin的亚克隆、表达与纯化

将分别含有细胞毒素gelonin基因片段的重组子pUC-gell和pUC-gelⅡ，按照预先设计的酶切位点，通过亚克隆得到含有gelonin全基因的重组子pUC-gel。然后将pUC-gel与pET28a同时用NdeI/EcoRI双酶切，相关片段构建成表达重组子pET-gel，并进行DNA序列测定。工程菌E.coli BL21/pET-gel表达产物经两步SP－Sepharose柱层析，可得电泳纯的重组gelonin，分子质量为28000u。无细胞体系蛋白质合成实验表明，其IC50（使蛋白质合成抑制50％所需浓度）为35μg/L。酶联免疫实验为阳性。     

AChRα211的分泌表达及其对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用

目的在毕赤酵母(P．pastoris)中分泌表达AChRα211，研究其对重症肌无力患者血清中AChRAb的清除作用。方法以质粒pUC—AChRα211为模板，PCR扩增人AChRα21 DNA片段，插入真核表达载体pPIC9K中。重组质粒转入P．paatoris GS115后，经甲醇诱导分泌表达AChRα211，用Sepharose Q离子交换柱和Superdex 75分子排阻层析进行纯化。Western blot和ELISA进行免疫活性分析后，将目的蛋白偶联于CNBr-Sepharose 4B树脂上，研究该免疫吸附剂对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用。结果双酶切鉴定和序列分析表明，AchRα21 DNA片段已正确插入到pPIC9K载体中。重组菌P．pastoris GS115／pPIC9K—AChRα211经甲醇诱导可分泌表达目的蛋白AChRα211，经阴离子交换柱和分子排阻层析可得95％纯AChRα211。并制备成免疫吸附剂。Western blot和ELISA分析表明，重组蛋白具有与天然AChRα亚基相似的免疫活性。免疫吸附实验表明该重组蛋白可特异性地去除肌无力患者血清中的AChRAb。结论在P．pastoris中分泌表达并纯化重组蛋白AChRα211，制备成一种新的免疫吸附剂AChRα211-Sepharose，可清除肌无力患者血清中的AChRAb。