β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究

目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05).感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05).结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达.成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础.     

CX3C趋化因子受体1对骨癌痛大鼠吗啡耐受时脊髓背角μ受体和辣椒素受体表达的影响

目的 评价CX3C趋化因子受体1(CX3 CR1)对骨癌痛大鼠吗啡耐受时脊髓背角μ受体和辣椒素受体(TRPVl)表达的影响.方法 清洁级成年雌性SD大鼠,体重180-200 g,月龄3月,经L3.4棘突间隙行鞘内置管,取鞘内置管成功的大鼠48只,采用随机数字表法,将大鼠随机分为4组(n=12):对照组(A组)、鞘内注射生理盐水组(AM组)、鞘内注射IgG组(GM组)和鞘内注射CX3CR1中和抗体组(BM组).A组仪手术暴露右侧胫骨七段;其余3组右侧胫骨上段骨髓腔注入Walker256 乳腺癌细胞10μl(400个/ μl)建立骨癌痛模型,术后第10天开始鞘内注射吗啡20tg/kg,2次/d,连续7d,建立骨癌痛-吗啡耐受模型,注射吗啡第8天分别经鞘内注射相应溶液10μl,1次/d,连续3d.分别于接种Walker 256乳腺癌细胞前(T0)、接种后第3、6、9天、注射吗啡第3、7天、鞘内注射抗体第3天(T1-T6)时测定机械缩足阈值(MWT)和机械缩足持续时间(MWD),于T6时测定痛阈后处死大鼠,取脊髓L4-6节段组织,采用Western blot法检测脊髓背角小胶质细胞CX3 CR1蛋白的表达,采用免疫组化法检测神经元μ受体和TRPV1的表达.结果 与A组比较,BM组T2.3.5时、AM组和GM组T2,3,5,6时MWT下降,MWD升高,T6时CX3CR1蛋白和TRPV1表达上调,μ受体表达下调(P＜0.01);与AM组和GM组比较,BM组T6时MWT上升,MWD降低,CX3CR1蛋白和TRPV1表达下调,μ受体表达上调(P＜0.01).AM组和GM组上述指标差异无统计学意义(p＞0.05).结论 CX3CR1可通过下调大鼠脊髓背角μ受体和上调TRPVI参与骨癌痛大鼠吗啡耐受的形成.     

紫杉醇诱导神经病理性疼痛大鼠脊髓背角5-羟色胺含量变化

目的观察紫杉醇诱导神经病理性疼痛大鼠脊髓背角5-羟色胺(5-HT)含量变化。方法雄性SD大鼠54只,体重约300 g,随机均分为正常对照组(A组)、紫杉醇溶媒组(B组)和紫杉醇组(C组)。分别于腹腔注药前1 d、注药后3、5、7、9、11、14、18、21 d检测大鼠机械缩爪阈值。腹腔注药前1 d、注药后7、14、21 d每组各处死大鼠4只,取脊髓腰膨大背角组织,用高效液相色谱荧光法测定5-HT含量。腹腔注药后14 d取大鼠右侧坐骨神经,透射电镜观察神经病变情况。结果与注药前1 d比较,C组机械缩爪阈值从紫杉醇注射后7 d开始显著降低,并持续至注药后21 d达最低值(P<0.05),且显著低于A、B组(P<0.05)。坐骨神经超微结构C组纤维髓鞘板层结构松散,排列紊乱、肿胀变形、厚薄不均,A和B组大鼠坐骨神经未见异常。C组脊髓背角5-HT含量注药后7 d开始显著升高,并持续至注射后21 d达最高值(P<0.05),且显著高于A、B组(P<0.05)。C组大鼠脊髓背角5-HT含量与机械缩爪阈值呈显著线性负相关(r=-0.981,P<0.05)。结论紫杉醇诱导的神经病理性疼痛大鼠脊髓背角组织中5-HT含量表达上调,该变化可能参与了紫杉醇所致神经病理性疼痛的发病机制。     

重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建

目的 构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.方法 将铁蛋白重链基因构建入线性化的慢病毒载体pGC-FU,以获得中间质粒pGC-FU-HF;进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒,以获得目的质粒pGC- agRNA- HF;通过病毒的包装和浓缩,应用Realtime PCR法检测重组慢病毒的滴度,应用NG108-15细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达.结果 抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体,病毒滴度2.00×109 TU/ml,该病毒转染NG108-15细胞后,β-arrestin2表达下调,铁蛋白表达上调.结论 成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.     

多专业联合干预对社区COPD患者的康复效果

目的:探讨多专业联合干预对社区COPD患者的康复效果,为促进社区COPD患者身心康复提供依据。方法:将60例住院治疗COPD患者按出院先后顺序分为研究组(30例)和对照组(30例)。对照组实施自我管理护理方式,研究组采用家庭访视的形式,实施医疗、护理、心理、药理、营养等多专业合作式干预方式,每月定期上门随访进行病情诊治、康复训练指导,随访时间为6个月。随访前和随访6个月末,分别采用肺功能测定仪、呼吸问卷(SGRQ)和症状自评量表(SCL-90)评定两组患者肺功能、生活质量和心理健康水平。结果:随访前,两组肺功能、SGRQ和SCL-90总分评定差异无统计学意义(P>0.05);随访6个月后,研究组肺功能各项指标最大肺活量(L)、1秒用力呼气量(L)、1秒用力肺活量(%)及呼气峰值流速(L/S)均明显高于对照组,差异具有统计学意义(t=4.92、2.70、3.41、2.54,P均<0.05);SGRQ和SCL-90总分均低于对照组,差异具有统计学意义(t=2.52、2.87,P均<0.05)。结论:多专业联合干预能够有效地稳定COPD患者的病情,提高肺功能、生活质量以及心理健康水平,对患者身心康复具有良好的效果。     

颅内注射罗哌卡因对大鼠胃癌痛阈的影响

目的 观察颅内注射局麻药罗哌卡因对大鼠骨癌痛阈的影响,探讨骨癌痛的机制. 方法 建立大鼠骨癌痛模型后,立体定位引导下在大鼠脑干延髓头端腹内侧区（rostral ventromedial medulla,RVM）置管,通过von Frey filaments, Pin Prick test, Ambulatory pain三种方法检测骨癌痛大鼠在RVM内给予罗哌卡因后痛阈的改变. 结果 构建骨癌痛模型后,大鼠痛阈呈现进行性下降趋势. 颅内微注射0.5%罗哌卡因后,骨癌痛大鼠的机械性痛觉超敏,机械性痛觉过敏,移动触诱发痛3种不同性质的疼痛痛阈均显著升高,痛觉行为显著改善. 结论 RVM区内注射局麻药罗哌卡因可以起到显著的镇痛效果,提示脑干RVM区在骨癌痛的形成和维持中起重要作用.     

β-arrestin 2抗基因RNA对小鼠C17.2神经干细胞μ阿片受体脱敏感化的影响

背景:前期实验中采用新型基因沉默方法--抗基因RNA下调了细胞内β-arrestin 2基因的表达,实现细胞水平的基因敲除效应.目的:在前期实验基础上,观察抗基因RNA下调小鼠C17.2神经干细胞β-arrestin 2基因表达后其对DAMGO诱导μ阿片受体脱敏感化的影响.方法:小鼠C17.2神经干细胞应用含体积分数为10%胎牛血清、10 mg/L青霉素和10 mg/L氨苄青霉素的DMEM培养基,置于37 ℃,体积分数为5% CO_2培养箱进行培养.待细胞长至80%汇合,用0.25%胰蛋白酶消化传代,每五六天传代1次.通过RT-PCR和免疫细胞化学法检测C17.2细胞μ阿片受体的表达.在脂质体介导下,将已被证实具有基因沉默效应的抗基因RNA片段转染C17.2细胞,荧光显微镜下观察转染24 h后绿色荧光蛋白的表达.应用μ阿片受体选择性激动剂DAMGO和[~(35)S]GTPγS结合实验检测C17.2细胞μ阿片受体与G蛋白的耦联能力.结果与结论:RT-PCR结果证实C17.2细胞内有μ阿片受体存在,而免疫细胞化学结果显示μ阿片受体主要在细胞膜和细胞浆中表达.荧光显微镜下观察可见转染质粒pGPU6/GFP/Arrb9的C17.2细胞中有绿色荧光蛋白的表达.[~(35)S]GTPγS结合实验结果显示:未应用DAMGO进行处理的细胞中,[~(35)S]GTPγS结合的刺激比率为(253±17)%;应用DAMGO预先对细胞进行处理后,刺激比率降为(113±14)%(P < 0.05);而转染β-arrestin 2抗基因RNA的细胞在DAMGO刺激下,[~(35)S]GTPγS结合的刺激比率则仍维持在(239±15)%,表明抗基因RNA下调β-arrestin 2的表达,可抑制μ阿片受体脱敏感的产生.     

骨癌痛大鼠脑脊液谷氨酸含量的检测及意义

目的:研究骨癌痛模型大鼠脑脊液兴奋性氨基酸谷氨酸含量的变化.方法:雌性SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只.Ⅰ为正常对照组;Ⅱ为D-Hank's组;Ⅲ为热灭活细胞组:大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注射热灭活的Walker256乳腺癌细胞10μL;Ⅳ为骨癌痛模型组.分别对各组大鼠行为学检测后,抽取大鼠脑脊液,应用反相高效液相色谱法,检测各组大鼠脑脊液内兴奋性氨基酸谷氨酸的含量.结果:Ⅳ组机械性痛觉缩爪阈值和热辐射痛觉缩爪阈值显著低于其他各组(P<0.05),而脑脊液中谷氨酸含量(19.41±0.64)μg/mL显著高于其他各组(P<0.05).Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组之间大鼠脑脊液谷氨酸含量无统计学差异(P>0.05).结论:中枢神经系统谷氨酸含量与骨癌痛的形成和维持密切相关.     

乙二胺四乙酸联合正丁醇在大鼠胫骨癌痛标本石蜡切片制作中的应用

目的 探索一种简便有效的制作大鼠胫骨癌痛标本石蜡组织切片的方法。方法 取大鼠胫骨癌痛模型组和正常组胫骨标本，使用乙二胺四乙酸（EDTA）加温脱钙联合正丁醇取代传统强酸脱钙、纯酒精脱水和二甲苯透明，制作石蜡切片后HE染色观察。结果 两组大鼠胫骨癌痛标本形态结构均保存完整。与传统方法相比，制片步骤简单，脱水和透明时间较为灵活，蜡块切割性能较好。结论 EDTA与正丁醇的联合应用，是大鼠胫骨癌痛标本石蜡组织切片制作适宜和可靠的方法。