地塞米松预处理对氧糖剥夺大鼠血脑屏障通透性的影响

目的探讨地塞米松(dexamethasone,DEX)对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)条件下大鼠血脑屏障通透性的影响。方法提取纯化大鼠脑微血管内皮细胞,建立血脑屏障OGD模型。在OGD不同时间点(0、30、60 min),以及DEX预处理OGD 60min时,应用辣根过氧化物酶渗漏实验分析血脑屏障的通透性;应用RT-PCR和western blot法分析大鼠脑微血管内皮细胞的紧密连接相关蛋白claudin-5的mRNA和蛋白的表达变化;同时应用免疫荧光方法观察细胞膜上claudin-5的变化。结果与对照组相比,OGD 30、60min,辣根过氧化物酶流量均显著升高;与OGD 60min相比,DEX预处理显著降低了辣根过氧化物酶流量。与对照组相比,OGD30、60min,claudin-5的mRNA和蛋白表达水平均显著降低;与OGD 60min相比,DEX预处理显著增加了claudin-5的mRNA和蛋白表达。免疫荧光观察claudin-5在细胞膜上的表达,与对照组相比,OGD 60min时claudin-5的表达明显减少,DEX预处理后显著增加了claudin-5的表达。结论 DEX预处理降低了OGD条件下的血脑屏障通透性,其机制之一是DEX增加紧密连接相关蛋白claudin-5的表达。     

EMAP-Ⅱ通过LKB1/AMPK/mTOR信号通路增加BTB的通透性

目的研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对体外血肿瘤屏障(BTB)通透性的影响及可能机制。方法建立体外BTB模型,EMAP-Ⅱ处理后,millipore电阻测量系统检测跨内皮细胞阻抗(TEER)值,采用Western blot方法检测p LKB1/LKB1、p AMPK/MAPK和p-m TORC1/m TORC1的蛋白表达水平;分别应用LKB1抑制剂radicicol、AMPK抑制剂compound C和m TORC1激活剂IGF1进行预处理后再给予EMAPⅡ,检测体外BTB模型的TEER值,Western blot方法检测紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的蛋白表达水平。结果与EMAP-Ⅱ0 h组相比,EMAP-Ⅱ可明显降低体外BTB模型的TEER值,增加p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK的表达水平,降低p-m TORC1/m TORC1的表达水平,以上指标在EMAP-Ⅱ作用1 h时效果最明显;radicicol、compound C和IGF1预处理能够部分阻断EMAP-Ⅱ的作用,使体外BTB模型的TEER值及紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达水平明显增加。结论 EMAP-Ⅱ能明显增加体外BTB模型通透性,其机制可能与激活LKB1/AMPK/m TOR信号通路相关。     

WWC3蛋白在胶质瘤干细胞中的表达及作用

目的 探讨WWC3在胶质瘤干细胞(GSCs)中的表达,以及通过调节Hippo通路调控GSCs增殖、迁移和侵袭的作用.方法 Western blot检测Hippo通路相关分子的表达.过表达WWC3后,检测MST1、LATS1和YAP的磷酸化与表达;免疫荧光检测YAP分布变化;CCK8和Transwell检测GSCs增殖、迁移和侵袭的变化.结果 WWC3、MST1和LATS1在GSCs中的表达均显著降低,而YAP的表达显著升高.过表达WWC3显著增加p-MST1/MST1、p-LATSl/LATSl、p-YAP/YAP的表达水平,抑制细胞核中YAP表达,抑制GSCs的增殖、迁移和侵袭.结论 过表达WWC3通过降低Hippo通路活性抑制GSCs的增殖、迁移和侵袭.     

CRNDE靶向调控miR-186影响胶质瘤干细胞生物学行为的分子机制

【目的】 存在于脑胶质瘤组织中的胶质瘤干细胞(GSCs)与恶性脑胶质瘤的发生、发展和复发密切相关。长链非编码RNA (lncRNA)的转录和功能失调能够参与肿瘤的发生发展。结直肠肿瘤差别表达基因(CRNDE)属于lncRNA,有报道CRNDE在胶质瘤组织中的表达上调。本项目旨在研究GSCs中异常表达的CRNDE是否影响GSCs的生物学行为及相关的分子机制。 【方法】 Real-time PCR检测GSCs和non-GSCs中CRNDE和miR-186的表达水平以及CRNDE对miR-186的成熟体、初级转录本和前体表达的影响。双荧光素酶报告基因实验验证CRNDE与miR-186以及miR-186与靶基因间存在靶向结合。RIP和RNA pull-down实验检测CRNDE与miR-186和Ago2之间的相互作用。CCK-8细胞活力检测、流式细胞术、transwell迁移、侵袭实验验证CRNDE和miR-186对GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。建立GSCs裸鼠移植瘤模型验证Lv-shCRNDE和Lv-miR-186单独或联合应用对人GSCs裸鼠移植瘤的生长及荷瘤鼠生存时间的影响。 【结果】 GSCs中CRNDE的表达较non-GSCs组显著上调;GSCs中miR-186的表达水平较non-GSCs组显著下调。沉默CRNDE显著抑制了GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭。通过生物信息学软件分析,预测到CRNDE与miR-186存在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验证明了CRNDE与miR-186的结合作用,明确了结合位点。在GSCs中,CRNDE能够结合Ago2,并与miR-186存在相互作用。下调GSCs中CRNDE的表达能显著上调miR-186的成熟体表达,而初级转录本和前体的表达均未见明显变化。过表达miR-186显著抑制了与GSCs增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白XIAP、noggin、MAPK1和PAK7的表达;沉默miR-186则显著上调了上述蛋白的表达。miR-186能够靶向结合XIAP、noggin、MAPK1和PAK7基因的3'非翻译区。沉默CRNDE后通过上调miR-186的表达,促进miR-186对靶基因XIAP、Noggin、MAPK1和PAK7的负性调控,抑制了GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭;过表达CRNDE结果则与之相反。与Lv-shCRNDE和Lv-miR-186单用相比,两者联合应用能够显著抑制人GSCs裸鼠移植瘤的生长,延长荷瘤鼠生存时间。 【结论】 CRNDE通过结合并负性调控miR-186的表达,减弱miR-186对靶基因XIAP、Noggin、MAPK1、PAK7的调节,影响GSCs的生物学行为。该研究能够为脑胶质瘤的治疗和药物研发提供新策略。     

siRNA-Tie1下调紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1增加血肿瘤屏障通透性

目的研究Tie1 AS和Tie1表达变化对血肿瘤屏障通透性的影响和相关机制。方法建立体外血脑屏障和血肿瘤屏障模型,Real-time PCR检测h CMEC/D3细胞中Tie1 AS和Tie1的表达水平。转染p IRES2-EGFPTie1 AS表达载体上调体外血肿瘤屏障模型h CMEC/D3细胞中Tie1 AS的表达,Western blot检测Tie1的表达变化。将si RNA-Tie1转染人h CMEC/D3细胞并建立体外血肿瘤屏障模型,跨内皮电阻测量系统分析血肿瘤屏障通透性变化;Western blot和免疫荧光法检测h CMEC/D3细胞中紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表达和分布变化。结果和正常脑微血管内皮细胞相比,体外血肿瘤屏障模型h CMEC/D3细胞中Tie1的表达显著增加,而Tie1 AS的表达显著降低。上调体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中Tie1 AS的表达水平,能够显著降低Tie1的表达。下调体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中Tie1的表达后屏障通透性显著下降,伴有claudin-5、occludin和ZO-1的表达下调以及在细胞膜上呈不连续分布。结论体外血肿瘤屏障模型内皮细胞中低表达的Tie1 AS能够负性调控Tie1的表达,进而通过调节紧密连接相关蛋白的表达和分布影响屏障的通透性。     

脑肿瘤药物转运的研究进展

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤.血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的存在极大地限制了抗肿瘤药物进入脑肿瘤组织,降低了脑肿瘤的治疗效果,因此有效开放BTB成为提高脑胶质瘤化疗疗效的重要策略.近年来,越来越多的研究证实了多种转运药物到达肿瘤组织的方法,如脑室内给药、对流增强转运法、干扰BT...     

C3 胞外酶抑制缓激肽诱导的血肿瘤屏障通透性的增加

 目的 研究RhoA的特异性抑制剂C3 exoenzyme对缓激肽诱导的血肿瘤屏障通透性的作用 方法 应用RhoA的特异性抑制剂C3 exoenzyme 预处理大鼠原代脑微血管内皮细胞后,测量跨内皮阻抗值,辣根过氧化物酶渗漏量,分析血肿瘤屏障的通透性的改变;应用Western-blot法检测紧密连接相关蛋白ZO-1的表达;应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白结构和分布的改变。结果C3 exoenzyme显著抑制缓激肽诱导TEER值的降低,HRP的升高;C3 exoenzyme显著抑制ZO-1的表达;C3 exoenzyme 抑制ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,抑制丝状肌动蛋白由细胞膜边缘向细胞中央区分布,分布于细胞边缘的F-actin明显增加,应力纤维形成明显减少。结论RhoA介导缓激肽开放血肿瘤屏障。 关键词：RhoA;缓激肽;血肿瘤屏障;紧密连接;ZO-1;肌动蛋白重排 中图分类号：R338.2     

新型疟疾传播阻断疫苗候选抗原的确定及其效应研究

【立论依据】 疟疾作为重要的全球性公共卫生问题之一,其防控已被写入联合国千年发展目标。我国也正式提出到2020年实现消除疟疾这一宏伟目标。“疟原虫发育阶段机理及其在疟疾传播阻断上的应用的研究”被国际疟疾消除专家委员会定位为今后疟疾研究的重点方向,由此提示切断疟原虫在人与媒介按蚊之间的传播是人类彻底消除疟疾的根本策略。 【设计思路】 鉴于疟原虫有性发育阶段的配子体是由人类至媒介按蚊传播的唯一形式,同时,目前研究的疟疾传播阻断疫苗(TBV)候选抗原P230、P48/45、P25/28均难以产生完全的传播阻断效应,因此,进一步拓展和深入与疟原虫有性发育密切相关的分子生物学和免疫学等综合基础性研究无疑是确立有效的传播阻断策略的必需依据。 【实验内容】 (1)采用生物信息学筛选、确定TBV候选蛋白。(2)提取疟原虫基因组DNA,PCR扩增目的基因,利用原核和无细胞表达系统表达及纯化重组蛋白。(3)实验动物免疫,收集抗血清,ELISA检测特异性抗体滴度,蛋白质印迹检测重组蛋白活性和特异性,IFA确定候选蛋白在疟原虫不同发育阶段的表达特点。(4)通过动合子体外培养和直接蚊喂养实验,评价传播阻断活性。(5)利用双交叉重组的遗传学分析技术建立敲除和标记候选基因反应体系,进一步评估候选蛋白的传播阻断效应。 【材料】 伯氏疟原虫(Pb ANKA)、BALB/c小鼠和媒介按蚊。 【可行性】 (1)课题组成员具备较扎实的理论基础和熟练的实验操作技术。(2)拥有鼠疟—媒介按蚊实验系统。 【创新性】 从切断疟原虫传播的根本环节出发,聚焦于新型疟疾传播阻断疫苗候选抗原的确定是本课题的创新之处。