一种新的土拨鼠α干扰素基因分型方法的建立及其意义

目的：建立新的土拨鼠α干扰素（IFN-α）基因分型方法，分析急性和慢性土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepati-tis virus，WHV）感染的土拨鼠肝细胞中不同型别的IFN-α基因表达谱及其意义。方法：利用已知序列和基因型的土拨鼠IFN-α基因克隆质粒，建立基于土拨鼠IFN-α基因序列的限制性片段长度多态性的土拨鼠IFN-α基因分型方法。PolyIC体外刺激正常土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC），调查正常土拨鼠PBMC受PolyIC刺激后IFN-α基因的表达谱。提取急性和慢性土拨鼠肝炎病毒感染的土拨鼠肝组织mRNA，RT-PCR扩增土拨鼠IFN-α基因，分子克隆后调查急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因表达谱。结果：建立了土拨鼠IFN-α基因限制性片段长度多态性分型方法。急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因的表达谱明显不同于正常动物的表达谱，假基因表达所占比例大。结论：新建立的土拨鼠IFN-α基因分型方法可用于分析土拨鼠不同组织中IFN-α的基因表达谱。     

照料者负性情绪与痴呆患者的认知和精神行为症状的相关性研究

目的探讨痴呆患者的认知和精神行为症状对其照料者负性情绪的影响,为更好地提供卫生服务提供依据。方法调查101例痴呆伴精神行为症状(BPSD)的患者及其照料者,采用蒙特卡利认知评估量表(MoCA)和神经精神评估量表(NPI)对痴呆患者评估,同时对照料者使用抑郁自评量表(SDS)和焦虑自评量表(SAS)进行评估,并作相关性分析。结果照料者的抑郁情绪和焦虑情绪与痴呆患者的精神行为症状总分呈正相关(P0.05)。其中,照料者的抑郁情绪与痴呆患者的焦虑症状呈正相关(P0.05),照料者的焦虑情绪与痴呆患者的妄想症状、异常运动行为、睡眠/夜间行为呈正相关(P0.05)。多重线性回归分析显示,痴呆患者的焦虑情绪以及异常行为是照料者抑郁情绪的影响因素(P0.01);照料者的年龄、痴呆患者的异常运动行为、睡眠异常是照料者焦虑情绪的影响因素(P0.05)。结论痴呆患者的焦虑情绪会影响照料者的抑郁情绪;痴呆患者的异常运动行为和睡眠异常可影响照料者的焦虑情绪。识别并且对痴呆患者的焦虑和异常行为等症状重点干预,有利于照料者对痴呆患者的长期照护。     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白的高效表达和B细胞表位鉴定

目的 建立高效表达土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg）的方法并对其B细胞表位进行鉴定。方法分别构建不同截短型WHcAg的质粒以了解能大量表达并形成WHV核心颗粒的区段，利用变性WHcAg制备单克隆抗体以寻找能与WHcAg线性B细胞表位结合的单克隆抗体。结果 WHcAg前144或149氨基酸残基能够大量表达并能形成颗粒样结构。这2种截短型WHcAg能够在大肠杆菌中表达并组装成直径为34肿的核心颗粒，最终纯化获得毫克级的核心蛋白。截短型WHcAg保留了全长WHcAg的抗原性，而且变性WHcAg存在另外的B细胞线性表位，利用变性WHcAg进行免疫制备单克隆抗体获得的5株抗体均针对WHcAg的N末端表位，该表位在WHcAg和HBcAg高度保守。结论 建立了高效表达WHcAg的方法，制备了针对WncAg单克隆抗体。并对WHcAg的线性B细胞表位进行了鉴定，发现WHcAg和HBcAg的N末端存在共同的线性B细胞表位。     

重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系。接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病最为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市。Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA6 3)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用。本文检测了本实验室研制的重组UreB(rUreB)和HpaA(rHpaA)的免疫反应性和抗原性、重组LTB(rLTB)和CTB(rCTB)的佐剂活性,以Hp…     

二甲双胍联合胰岛素泵治疗妊娠期糖尿病 及对血清YKL-40、Irisin 水平的影响

目的 探讨二甲双胍联合胰岛素泵皮下注射治疗妊娠期糖尿病患者对其血清人软骨糖蛋白-39 （YKL-40）及鸢尾素（Irisin）水平的影响。方法 选取2015 年7 月—2017 年1 月贵州省人民医院收治的140 例妊娠期糖尿病（GDM）患者,依照随机数字表法分为观察组和对照组,每组70 例。观察组采用二甲双胍 联合胰岛素泵皮下注射治疗,对照组采用二甲双胍联合胰岛素皮下注射治疗,治疗12 周后,比较两组患者疗 效及血清YKL-40、Irisin 水平变化。结果 观察组治疗总有效率与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）, 观察组高于对照组;观察组血糖达标时间、胰岛素用量、治疗后血糖相关指标（TC、TG、LDL-C、FPG、 FBG、HbAlc）及治疗后血清YKL-40 水平与对照组比较,差异均有统计学意义（P <0.05）,观察组低于对照 组;观察组治疗后血清Irisin 水平与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,观察组高于对照组;观察组 产妇妊娠结局异常率和新生儿异常结局发生率与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,观察组均低于对 照组。结论 二甲双胍联合胰岛素泵皮下注射治疗GDM 患者疗效优于二甲双胍联合胰岛素皮下注射治疗,在 血糖控制和减少并发症方面疗效确切,并能降低血清YKL-40 水平,升高Irisin 水平,改善胰岛素抵抗和胰岛 β 细胞的功能,对于妊娠期糖尿病患者治疗具有重要价值。     

中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定

目的 探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因，克隆并构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚．氯仿法提取上述钩体的基因组DNA，高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统，不同浓度lPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白rOMPLI表达情况。分别用兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPLI血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用。结果 上述17株钩体均具有OmpL1基因，但至少可分3种基因型：OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。与文献报道比较，所克隆的OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1／3基因核苷酸序列同源性分别为93．87％～94．08％、89．82％～100％和80．89％～81．72％，其氨基酸序列同源性分别为93．13％～98．75％、91．87％～100％和85．63％～88．44％。IPTG诱导后pET32a-OmpL1/1．E．coli／BL21DE3和pET32a-OmpL1/2-E．coliBL21DE3的rOMPL1/1和rOMPL1/2表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％。rOMPL1，1和rOMPLl，2均能与兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原血清发生免疫结合反应，免疫家兔可获得抗体。兔抗rOMPL1/1和rOMPL1/2血清对上述17株钩体的MAT效价为1：2．1：32，1：2．1：16稀释时均能有效地阻断钩体黏附J744A．1细胞。结论 所检测的钩体均有OmpLl基因，但至少可分为3种不同的基因型。所构建的原核表达系统表达的rOMPL1/1和rOMPL1/2具有良好的免疫原性和免疫反应性。rOMPL1/1和rOMPL1/2具有属特异性、钩体表面的膜蛋白抗原，能诱生交叉凝集抗体，并具有钩体黏附阻断的作用。     

土拨鼠α干扰素新亚型基因的克隆及生物学活性分析

目的 克隆土拨鼠α干扰素（IFN-α）新亚型基因，用于土拨鼠HBV模型探索IFN-α治疗慢性乙型肝炎策略；调查慢性土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHY）感染的土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC）干扰素功能状况。方法 poly（I-C）体外刺激正常和慢性WHV感染的土拨鼠PBMC，分析其表达的干扰素生物学活性。利用分子克隆技术对土拨鼠IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型并进行真核表达后检测表达产物生物学活性。结果 poly（I-C）刺激体外培养的土拨鼠PBMC后，慢性感染土拨鼠PBMC分泌的干扰素的活性显著差异低于正常土拨鼠（P〈0．01）。获得36个土拨鼠IFN-α基因序列克隆，测序分析后，发现有10个克隆是新亚型基因，其中8个为功能基因亚型，2个为假基因亚型，病毒保护试验证明只有功能基因亚型具有生物学活性。结论 慢性WHV感染的土拨鼠细胞免疫功能受损。新的土拨鼠IFN-α亚型基因的克隆为在土拨鼠HBV动物模型上进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略提供了新的材料。     

筛选出一株可识别多种变异HBsAg的单克隆抗体及其应用

目的 制备筛选可识别变异表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb).用筛选出的单克隆抗体建立检测变异HBsAg的ELISA实验方法.方法 用血源HBsAg免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗-HBs单克隆抗体.不同单克隆抗体包被酶标反应孔,检测真核细胞表达的野生及变异HBsAg,了解各种单克隆抗体的反应模式 .筛选出可以较好识别变异HBsAg的单克隆抗体Hb1,优化该抗体ELISA检测HBsAg的方法,与 8种HBs Ag检测试剂比较检测变异HBsAg的能力.结果 经过筛选,得到一种可以较好识别包括G145R在内大多数变异HBsAg的单克隆抗体.检测变异HBsAg的能力优于市售HBsAg 诊断试剂.结论 用本实验制备的单克隆抗体可以用于ELISA检测变异HBsAg,减少HBsAg变异株的漏检率.     

PD-1/PD-L1抑制性通路在病毒性感染中的研究进展

杀伤性T细胞(CTL)是病毒感染过程中主要的效应细胞.在急性病毒性感染中,CTL细胞通过杀伤病毒感染的细胞,分泌抗病毒细胞因子从而有效清除病毒.而在慢性病毒感染过程中,病毒特异性CTL发生克隆耗竭,细胞数量少,细胞功能受损,分泌细胞因子能力下降.目前证明,CD28家族成员Programmed Death-1(PD-1)是一种重要的细胞表面分子,能够抑制CTL细胞功能,参与外周免疫耐受,维持T细胞克隆耗竭,保护机体不受免疫病理损伤.在慢性病毒性感染中,T细胞表面的PD-1与其受体PD-L1/2结合后,传递抑制性信号,下调外周T细胞功能.阻断PD-1通路,能够重建CD8+T细胞功能,抑制病毒复制,促进病毒清除.因此,通过干扰PD-1/PD-L1抑制途径进行免疫调节,可能是处理慢性病毒感染性疾病的一个新方法.     

重组改构人肿瘤坏死因子联合化疗治疗晚期肿瘤的临床观察

肿瘤坏死因子 (TNF)是由激活人巨噬细胞产生的一种可溶性多功能细胞因子 ,经国内外研究表明TNF能够相对特异地杀伤肿瘤细胞 ,引起肿瘤坏死。第四军医大学及上海赛达生物药业有限公司用蛋白质工程技术改造了天然TNF ,制成高活性 ,低毒性基因工程TNF ,即重组改构人肿瘤坏死因子 (nrhTNF)。根据国家药品监督管理局 (2 0 0 0 )制申体字第 0 4号文 ,我院作为Ⅲ期临床试验参研单位之一 ,于 2 0 0 1年 7月至 2 0 0 2年 7月参加了nrhTNFⅢ期临床试验的多中心、随机对照试验 ,以比较nrhTNF加化疗与单纯化疗治疗晚期恶性肿瘤的有效性及nrhTN…