土拨鼠α干扰素新亚型基因的克隆及生物学活性分析

目的 克隆土拨鼠α干扰素（IFN-α）新亚型基因，用于土拨鼠HBV模型探索IFN-α治疗慢性乙型肝炎策略；调查慢性土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHY）感染的土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC）干扰素功能状况。方法 poly（I-C）体外刺激正常和慢性WHV感染的土拨鼠PBMC，分析其表达的干扰素生物学活性。利用分子克隆技术对土拨鼠IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型并进行真核表达后检测表达产物生物学活性。结果 poly（I-C）刺激体外培养的土拨鼠PBMC后，慢性感染土拨鼠PBMC分泌的干扰素的活性显著差异低于正常土拨鼠（P〈0．01）。获得36个土拨鼠IFN-α基因序列克隆，测序分析后，发现有10个克隆是新亚型基因，其中8个为功能基因亚型，2个为假基因亚型，病毒保护试验证明只有功能基因亚型具有生物学活性。结论 慢性WHV感染的土拨鼠细胞免疫功能受损。新的土拨鼠IFN-α亚型基因的克隆为在土拨鼠HBV动物模型上进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略提供了新的材料。     

中国旱獭α干扰素家族基因的克隆及序列分析

目的 克隆中国旱獭α干扰素（IFN-α）家族基因，以期利用克隆的中国旱獭家族IFN-α在动物模型上探索慢性乙型肝炎有效的干扰素治疗方案和策略。方法 利用分子克隆技术对中国旱獭IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型、系统发生树分析、同源性比较及理化特性分析。结果从112个中国旱獭IFN-α基因克隆中获得18个独立的不重复序列，其中的14个序列来自4次以上相对独立的PCR产物，将它们分为14个基因亚型，其中8个是功能基因亚型，6个是假基因亚型。中国旱獭IFN-α各基因亚型之间在核苷酸水平和氨基酸水平有很高的同源性，平均分别为93％和85％，前体蛋白N端含23个氨基酸的疏水性信号肽。结论 中国旱獭巧IFN-α家族至少有14个基因亚型，这些基因的克隆可能应用于中国旱獭HBV动物感染模型，进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略。     

一种新的HLA—II类基因分型方法——PCR／SSP技术的建立

ＰＣＲ／ＳＳＰ是一种新的基因多态性分析技术，可用于ＨＬＡ复合体及其他具有多态性特点２的基因分型。我室于１９９３年建立这种方法，并对正常人、重症肌无力患者、全身性红斑狼疮患者、骨髓移植供／受者进行了ＨＬＡ－ＤＲＢ１、－ＤＱＢ１基因型别分析。与其它ＨＬＡ基因分型方法相比，ＰＣＲ／ＳＳＰ具有简便、快速、准确及重量性好等特点。本文介绍ＰＣＲ／ＳＳＰ技术的原理、方法、特点以及常见问题的处理。     

鸭α干扰素成熟蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鸭Ⅰ型干扰素基因是在1995年由Schults等成功克隆的。基因总长度为1．2kb，其蛋白质由191个氨基酸组成，其中N末端的30个疏水氨基酸为信号肽，成熟多肽为161个氨基酸。本实验利用PCR技术从pMD-18-duIFN-α重组体上克隆出鸭α干扰素成熟蛋白基因(mDuIFN-α)，并用pET30a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中进行了高效表达。     

HCV反向点杂交基因分型方法的建立

目的利用反向点杂交技术建立HCV基因分型新方法。方法在HCV5’端非编码区（5’NCR）设计引物和分型探针（1．2．3．6型）,采用反向点杂交分型技术对53例HCVRNA阳性（浓度均在102～107IU／mL之间）血清进行分型,并以基因序列分析作为金标准,对新方法的敏感性、特异性和重复性进行评价。结果反向点杂交基因分型新方法检出的基因型有52例：1b型32例占60．38％,2a型4例占7．55％,6a型8例占15．09％．3b型8例占15．09％;未检出的基因型有1例,用基因序列分析也未能确定型别（失败的原因应是该HCVRNA扩增产物浓度偏低2．24×10^2IU／mL）。本研究的方法敏感性为98．1％,特异性为100％,随机抽取20份标本再次检测的结果与前次检测的结果完全一致,重复性好。结论相对现有的型特异性PCR分型、基因芯片、核酸序列分析等各种方法,反向点杂交技术用于HCV基因分型是一种准确有效和简便经济的方法。     

三种α干扰素亚型单抗的特性鉴定

采用中和活性法、免疫印迹法 ,通过α1b、α2b、α2a干扰素与自制的 6株单抗反应的结果差异 ,对 3种干扰素加以鉴别。中和活性结果表明 ,AK1单抗只与IFN α1b有中和活性 ,AK2单抗只与IFN α2有中和活性 ,而AK4单抗与IFN α1b和IFN α2b皆有中和活性。免疫印迹结果表明 ,AK1单抗只与IFN α1b有印迹反应 ,AK2与IFN α2有印迹反应 ,而AK4单抗与IFN α1b和IFN α2b皆有印迹反应 ,与IFN 2a无印迹反应。AK1或AK2能够鉴别IFN α1b与IFN α2 ,AK4能够鉴别IFN α2a与IFN α2b。     

干扰素基因定向进化库的建立及初步筛选

目的构建α干扰素基因家族定向文库。方法利用D NAshuffling技术对人、鸡和猪α干扰素基因进行人工改造，结合噬菌体展示技术构建噬菌体基因改组文库，并对文库进行验证。结果构建了α干扰素基因家族定向文库，其容量为3．5×10^7pfu；测序得到了3条与猪、人α干扰素基因高度同源的序列。结论得到了1个高质量的α干扰素基因家族定向文库，为今后筛选高效的α干扰素奠定了基础。     

一种新的HLA─Ⅱ类基因分型方法——PCR／SSP技术的建立

ＰＣＲ／ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ，序列特异性引物）是一种新的基因多态性分析技术，可用于ＨＬＡ复合体及其他具有多态性特点的基因分型。我室于１９９３年建立这种方法，并对正常人、重症肌无力患者、全身性红斑狼疮患者、骨髓移植供／受者进行了ＨＬＡ－ＤＲＢ１、－ＤＱＢ１基因型别分析。与其它ＨＬＡ基因分型方法相比，ＰＣＲ／ＳＳＰ具有简便、快速、准确及重复性好等特点。本文介绍ＰＣＲ／ＳＳＰ技术的原理、方法、特点以及常见问题的处理。     

乙型肝炎病毒基因分型方法及和分子流行病学意义

自１９９８年Ｏｋａｍｏｔｏ初步建立了乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因Ａ～Ｄ分型标准后，目前ＨＢＶ ＤＮＡ基因型已分为Ａ～Ｆ六型。本文就乙型肝炎病毒基因型的分型方法及其临床和分子流行病学意义的有关情况作一简要综述。     

丙型肝炎病毒不同分型方法的分析及分型意义

丙型肝炎病毒(HCV)是经血液传播的一种高度异质性单股正链RNA病毒,基因序列为:5＇NCR-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3＇NCR,现已证实HCV基因组各部位的变异程度不一致,5＇非编码区(5＇NCR)最为保守,在编码基因中核心区(C区)有着高度遗传保守性,非结构(NS)区基因次之,编码包膜蛋白的E2/NS1区可变区最高.许多学者分析了世界各地不同分离株HCV基因序列,发现分离株间核苷酸及氨基酸同源性有较大的差异.但是由于没有HCV体外培养系统,许多传统的病毒学分类方法无法应用,HCV的分类将不可避免的几乎全部依赖于各株之间全基因组序列比较或某一片段的序列比较.以下对HCV不同的分型方法、原理及分型的意义作一概述.     

HLA-DRB1基因分型新方法的建立

目的改进以测序为基础(sequencing based typing,SBT)的HLA-DRB1基因分型方法,从而降低其分型成本和工作量。方法根据序列比对结果将DRB1基因分为6个簇(cluster),并设计6对簇特异引物(cluster specific primer,CSP),依据其对应的等位基因簇在人群中的频率高低,利用巢式PCR和CSPs渐进式地扩增,PCR产物纯化后进行测序分型。我们将此方法命名为以频率为基础的CSP-SBT法(Frequency based-CSP-SBT,FB-CSP-SBT)。结果用FB-CSP-SBT法对224个中国南方汉族冠心病患者临床样本进行HLA-DRB1等位基因分型,总共鉴定出31个等位基因型,覆盖了所有的HLA-DRB1等位基因谱系。其中,4个在人群中频率最高的簇依次为DR52(47.99%,包含DRB1*03、DRB1*08、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13和DRB1*14等6个DRB1等位基因谱系)、DR15(19.20%,包括DRB1*15和DRB1*16)、DR79(18.53%,包括DRB1*07和DRB1*09)和DR04(12.72%),占整个人群的98%以上。观察到的杂合性(heterozygosity)为0.9107,与前人报道的HLA-DRB1基因位点的杂合性相似,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.3517)。对于每个样本,利用此方法对DRB1基因进行测序分型比传统的SBT至少减少6～8个PCR反应,同时还减少了测序反应的数目。结论用FB-CSP-SBT法可以准确地对HLA-DRB1基因进行分型,比传统的SBT法减少了工作量并降低了分型成本。     

土拨鼠白细胞介素15的克隆、表达和活性分析

目的对土拨鼠白细胞介素15（woodchuck interleukin 15，wIL-15）分子进行克隆、表达并鉴定其活性，为进一步研究IL-15在嗜肝病毒感染中的作用以及评价IL-15用于治疗慢性HBV感染奠定基础。方法用IL-15的保守引物将wIL-15基因克隆、测序并进行分析，构建wIL-15的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达，分离纯化后用淋巴细胞增殖试验检测其生物学活性。结果wIL-15的完整编码序列为489nt（与其他哺乳动物IL-15编码序列的同源性高达78％～87％），编码162AA长度的前体蛋白（与其他哺乳动物IL-15蛋白的同源性高达70％～80％），其信号肽为N端的48AA，成熟蛋白由114AA组成。土拨鼠IL-15与灵长动物IL-15的同源性高于啮齿动物。带有His-tag的成熟蛋白，可以在大肠杆菌中表达，分离纯化后，可以刺激Con A活化的小鼠脾细胞和土拨鼠PBMC增殖（其SI值可高达10以上），并存在明显的剂量依赖性。结论（1）wIL-15与其他哺乳动物IL-15高度同源，并且与灵长类动物的IL-15更接近。（2）wIL-15可以在大肠杆菌中表达，并在纯化后能刺激小鼠和土拨鼠淋巴细胞增殖，表现出较好的生物学活性。     

α干扰素中和抗体对慢性病毒性肝炎疗效的影响

目的　探讨慢性病毒性肝炎患者中α干扰素(αIFN)中和抗体(NA)的产生及其对干扰素疗效的影响。方法　采用抗病毒中和生物测定法检测了30名健康人及116例经三种亚型αIFN治疗的慢性病毒性肝炎患者血清中的NA。结果　健康人及IFN治疗前的患者中未检出NA,治疗后共20例(172%)NA阳性。NA在IFN治疗后2个月即可出现,6个月达高峰(20例全部阳性),至9个月后则有所下降。其中αIFN2a、αIFN2b和αIFN1b治疗组的NA阳性率分别为346%、132%和115%。NA阳性组、高滴度组的病毒阴转率明显低于NA阴性和低滴度组(P<0.01;P<0.05)。而NA阳性组病毒复发率则显著高于NA阴性组(P<0.05)。结论　αIFN治疗后可产生NA,且具有一定的时间规律性。不同亚型的αIFN其NA的产生率不同。NA可中和IFN的活性而影响干扰素的抗病毒疗效。     

A reliable,high-resolution and high-throughput genotyping method for HLA-DRB1

Human leukocyte antigen (HLA) DNA typing is an essential part to identify a donor who may be a good match for the patients who need haematopoietic stem cells from bone marrow. Thus, fetching quickly high-resolution genotype is very important at present. However, current HLA DNA typing methods especially for HLA-DRB1 generally yielded ambiguous typing results because of high degree of heterozygosity on exome region and primer pairs design limitations, which generally amplified only exon2 of HLA-DRB1 and the position of its primer pairs is on exome region. To solve this problem, we developed a reliable, high-resolution and high-throughput (RHH) sequence based typing approach for HLA-DRB1 through massively parallel paired-end sequencing. Several primer pairs were designed to amplify three exon regions, which are part of exon1, the whole region of exon2 and exon3 of HLA-DRB1, to genotyping for HLA-DRB1 by synthesis. 94 samples were included to analyze and the highly successful genotyping ratio (98.94%) and no ambiguous genotyping result demonstrated the accurate performance of our method for HLA-DRB1 genotyping.     

A novel method for pestivirus genotyping based on palindromic nucleotide substitutions in the 5′-untranslated region

A simple and practical method was developed for pestivirus genotyping based on analysis of the secondary structures in the 5′-untranslated region (UTR). Three stable stem-loop structures, V1, V2 and V3, predicted by computer in the 5′-UTR, included strictly conserved consensus base-pairings which are shared by all the genotypes of pestivirus or are characteristic to each genotype of pestivirus. On the basis of the palindromic nucleotide substitution at the secondary structural level, six genotypes have been identified among pestivirus strains, irrespective of the cytopathic and non-cytopathic biotypes. They are genotypes Ia, Ib, Ic and II in bovine viral diarrhea virus, genotype III in border disease virus, and genotype IV in classical swine fever virus. The stable stem-loop structures, which were maintained by palindromic nucleotide substitutions in the stem region, may represent references for the classification and identification of pestivirus species and/or genotypes.     

The woodchuck: A model for therapeutic vaccination against hepadnaviral infection

Interferon-α and nucleoside analogues are available for the treatment of chronic hepatitis B virus (HBV) infection but do not lead to a satisfactory result. New findings about the immunological control of HBV during acute infection suggest the pivotal role of T-cell mediated immune responses. Several preclinical and clinical trials were undertaken to explore the possibility of stimulating specific immune responses in chronically infected animals and patients by vaccination. However, vaccination with commercially available HBV vaccines in patients and immunization in woodchucks with core or surface proteins of woodchuck hepatitis virus (WHV) did not result in effective control of HBV and WHV infection, suggesting that new formulations of therapeutic vaccines are needed. Some new approaches combining antiviral treatments with nucleoside analogues, DNA vaccines and protein vaccines were tested in the woodchuck model. It could be shown that therapeutic vaccinations are able to stimulate specific B- and T-cell responses and to achieve transient suppression of viral replication. These results suggest the great potential of therapeutic vaccination in combination with antivirals to reach an effective and sustained control of HBV infection.     

HLA-A位点PCR-SSP基因分型和血清学分型的比较

目的：建立优化ＨＬＡ－Ａ位点ＰＣＲ－ＳＰ分型方法。方法：采用普通扩增仪和Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管对细胞系ＤＮＡ和３７个健康正常人进行基因分型,血清学检测采用标准淋巴细胞毒试验方法。结果：发现引物浓度和浓度比、ＤＮＡ的纯度及酶的选用,是影响ＨＬＡ－Ａ位点ＰＣＲ－ＳＳＰ分型准确性的重要因素。该方法对３７个标本的基因分型结果与血清学结果相符合。结论：ＰＣＲ－ＳＳＰ方法具有简便准确的优点,可以作为ＨＬＡ－Ａ位     

土拨鼠肝炎病毒野毒及前C人工变异株的体外表达

１８９６和１８９８的Ｇ→Ａ变异是乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ变异的热点，１８９６变异导致ＨＢｅＡｇ翻译中断。这种变异被认为改变了ＨＢＶ的生物学特性，因而与慢性肝炎和重症肝炎相关。我们以人工变异的方法分别使野毒株土拨鼠肝炎病毒ＷＨＶ－８相当于ＨＢＶ１８９６及１８９６和１８９８位点产生Ｇ→Ａ变异，并构建了首尾相连的双体质粒。分别用这些质粒转染ＨｅｐＧ２细胞，结果其ＤＮＡ复制水平和转录水平未见明显差异。说明这种前Ｃ热点变异不影响ＷＨＶ复制。