鳃-耳综合征一家系临床表型及遗传学特征分析

目的探讨一个鳃-耳综合征家系的表型特征,进行候选致病基因的突变筛查。方法经知情同意,对调查对象进行全身检查以及听力学和颞骨CT评估,获得血样标本;整理分析家系资料并绘制系谱图;用基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA,进行鳃-耳-肾综合征相关基因EYA1、SIX1和SIX5全编码外显子的序列分析。结果该家系共4代31人,7人具有鳃-耳-肾综合征相关症状,系谱分析符合常染色体显性遗传特征。6名患者主诉听力下降,为最常见临床表现,其它症状有耳前瘘管2人次、鳃裂瘘3人次和耳廓畸形4人次,均无肾脏畸形表现。2名患者纯音听力图示双耳混合性聋,颞骨CT检查见中耳和内耳发育异常,候选致病基因筛查均检测到EYA1 c.922C>T突变。结论该家系表型特征符合鳃-耳综合征诊断,但家系内患病个体间临床表现具有异质性。EYA1 c.922C>T突变是本家系致病的主要分子基础。     

致聋基因EYA4在斑马鱼胚胎发育中的时空表达特征分析

目的研究致聋基因EYA4在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达及其定位,为进一步利用斑马鱼模型探索其可能的致病机制奠定基础。方法利用生物信息学分析斑马鱼与人EYA4基因的同源性,同时通过整胚原位杂交和半定量PCR分析斑马鱼eya4基因在早期64细胞胚胎、oblong-sphere、50%-epiboly、15-somite、24hpf、36hpf、48hpf、60hpf、72hpf和1周的时空表达分析。结果生物信息学分析显示斑马鱼eya4与人EYA4基因高度同源。半定量PCR结果显示斑马鱼eya4在胚胎发育早期(64细胞～50%-epiboly)不表达,15-somite期逐渐开始表达并于24～48hpf达到高峰,此后表达水平稍降低并维持在一定水平。全胚原位杂交检测结果显示eya4在斑马鱼64-细胞,oblong-sphere和50%-epiboly时期均未表达,提示该基因为非母源性表达,在15-somite期开始出现可检测的表达,24～48hpf期表达水平达到顶峰,并且在头部神经系统、听囊内耳毛细胞和侧线系统中均有表达,至60hpf～1-week期表达水平减弱并维持稳定在一定水平。结论斑马鱼eya4与人致聋基因EYA4具有高度同源性,通过研究eya4在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达模式,可为后续利用斑马鱼作为动物模型深入研究人类EYA4在胚胎发育中的作用及其突变致聋机制奠定重要的实验基础。     

生物医学前沿进展在高等医学教育中的作用与实施策略

近年来生物医学研究发展迅速,生命组学、系统生物学、元基因组学、组织工程与干细胞技术、动物克隆技术等前沿领域的研究成果越来越多地应用于临床实践,使得人类疾病的诊断、治疗和预防方法和方式发生革命性的变化。这种发展必将对高等医学教育产生深刻影响,主要体现在医学人才培养目标的制定、医学课程体系与教学内容的更新、师资提升和教育资源配置等方面。生物医学的快速发展将促使医学教育的课程体系更加开放,基础医学教学内容更前沿,临床医学教学纳入更多新技术、人工智能和信息化等学科内容,同对教师素质和教学资源提出更高要求。     

特大常染色体显性遗传聋家系听力学特征及候选致病基因突变筛查

目的探讨一中国常染色体显性遗传聋大家系的听力学特征,进行已知致聋基因已知突变位点的筛查。方法经知情同意,对家系成员进行全身检查及听力学检测,获得血样标本;整理分析家系资料并绘制系谱图;用基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA。对2例家系患者DNA进行GJB2和GJB3基因全部编码区突变检测,对其余23个已知常染色体显性遗传性耳聋(DFNA)基因的74个已知突变位点所涉及的50个外显子进行PCR扩增和直接测序分析。结果该家系共7代199人,现存4代176人,耳聋患者54人。系谱分析显示,耳聋表型代代相传,男女患病人数分别为24和30,符合常染色体显性遗传特征。听力学表现为:迟发性、进行性、双侧对称性、感音神经性听力损失,首先是高频区受损,并快速向中、低频扩展。GJB2、GJB3基因全部编码区及其余23个DFNA基因已知突变位点的序列分析均无阳性发现。结论该家系是一个非综合征型常染色体显性遗传聋大家系,耳聋表型为迟发性、进行性、双耳对称性感音神经性听力损失;初步分子遗传学分析提示可能由新基因或已知基因的新突变致病。     

人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定

目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。     

常染色体显性遗传性听神经病家系全外显子组测序分析

目的：在多年围绕1个常染色体显性遗传性非综合征型听神经病家系开展系统分子遗传学研究的基础上,进一步探讨该家系耳聋的致病机制,以期发现新的听神经病致病基因和突变位点。方法：对3例耳聋患者和1例配偶进行全外显子组测序,初步筛选出与家系耳聋相关的候选致病基因。采用PCR-Sanger测序法,检测上述候选基因变异是否与家系表型共分离。最后,以50例与研究家系无关的听力正常人为对照,检测候选致病突变在正常群体中的突变频率和SNPs遗传多态性。结果：全外显子测序分析得到41个候选致病基因突变;用PCR-Sanger测序法对核心家系的9名成员和2名家系外听力正常人进行验证,仅发现1个基因突变（ALOX15B 7942797 C>T）与家系耳聋表型共分离。选取50例家系外正常对照的DNA样本对ALOX15B基因进行PCR扩增和序列分析,结果显示有2例听力正常人也检测到该基因的同一变异,提示该变异为SNPs遗传多态性。结论：对核心家系成员的全外显子组测序分析和Sanger测序法验证未发现有意义的突变位点,排除了该家系耳聋由基因编码区突变及Indels致病的可能性。     

ＴＳＡ诱导ＭＣＦ-７细胞毒性过程中转录调节的实验研究

目的:研究制滴菌素(trichostatin A,TSA)诱导乳腺癌细胞株MCF-7的细胞毒性作用及基于该效应可能的转录调节基础.方法:采用MTT法观察不同浓度TSA对MCF-7细胞的抑制作用,Annexin-V/PI双染观察该梯度下的细胞凋亡情况,细胞周期分析检测不同时间段的周期变化,RT-PCR分析TSA处理前后ERaα、myc-c、P21、cyclin-D及Bcl-2基因的转录表达情况.结果:TSA对MCF-7细胞的抑制作用具有时间和剂量的依赖性,Annexin-V/PI双染分析显示在TSA处理48 h后,随其浓度的增加,细胞的凋亡率依次升高,0.5 μmol/L TSA作用,细胞凋亡率为33.82%;细胞周期分析检测显示在0.5 μmol/L TSA的作用下,MCF-7细胞出现周期阻滞.但未检测出细胞凋亡.RT-PCR分析显示除P21基因上调外,ERα、myc-c、cyclin-D及Bcl-2均下调,同朝着增殖抑制、周期阻滞及凋亡的方向进展.结论:TSA能诱导MCF-7细胞的细胞毒性作用,其机制可能与转录调节有关.     

非综合征型耳聋GJB2基因和mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变分析

目的:分析南京聋校散发性耳聋患者GJB2基因突变率和线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA A1555G基因突变率.方法:收集聋校学生135名和健康对照人群162名外周血样本,PCR扩增GJB2和mtDNA 12SrRNA基因,通过限制性内切酶酶切鉴定突变热点,对PCR产物直接测序进行突变确定.结果:对GJB2检测结果显示:散发性耳聋患者样本中发现9种碱基改变(V27I、E114G、I203T V37I、176-191del16、235delC、299-300delAT、T123N和504insGCAA),其中235delC为主要突变方式,携带率为27.41%,其中纯合突变18例,杂合突变19例;162例正常对照中发现了15种碱基改变,其中4种为常见多态.散发聋135例和正常对照162例共计297例样本中未发现有mtDNA 12SrRNA A1555G位点突变存在;结论:GJB2基因突变是引起散发性非综合征耳聋患者听力损失发生的重要原因,不同人种GJB2基因的突变热点存在差异,235delC是GJB2基因在中国人中的主要致病突变位点;GJB2基因在人群中存在较多类型的突变和较多形式的多态性;在散发性耳聋中mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变率明显低于全国平均水平.     

开设细胞遗传学综合实验 拓展医学生实践技能

细胞生物学与遗传学实验技术正逐渐渗透到医学实践中,成为医学生学习专业知识的基础。系统整合优化细胞生物学与医学遗传学实验内容,形成内容严谨、形式多样的综合实验体系,对培养医学生综合素质非常重要。因而,开设以“学生是主体”的综合实验教学成为与基础医学教育相适应的现代医学发展的必然趋势。     

大鼠耳蜗前体细胞的体外培养与分化鉴定

目的:分离?培养大鼠的耳蜗前体细胞,鉴定其增殖和分化能力,分析内耳发育相关基因在其分化中的表达?方法:从新生大鼠的耳蜗组织中分离获得前体细胞,进行体外培养,并加入血清诱导分化,通过免疫细胞化学的方法鉴定其增殖和分化为毛细胞的能力,利用荧光定量PCR的方法分析不同分化阶段的耳蜗前体细胞中内耳发育相关基因的表达?结果:原代培养的耳蜗前体细胞经免疫细胞化学鉴定呈nestin?BrdU阳性,经血清诱导分化后呈myosin Ⅶ A阳性?荧光定量PCR的结果表明Sox2?CyclinA2在耳蜗前体细胞分化的过程中表达逐渐下降,而Jagged1在分化过程中表达不断升高?结论:分离的耳蜗前体细胞具有增殖能力和分化为毛细胞的潜能,在其分化过程中Sox2?CyclinA2和Jagged1可能参与调控大鼠前体细胞的分化和耳蜗组织的发育?