长链非编码RNA MCM3AP-AS1在胆管癌细胞中的表达及其功能

背景与目的 长链非编码RNA MCM3AP-AS1（MCM3AP-AS1）在原发性肝癌、乳腺癌及胶质母细胞瘤等多种肿瘤中发挥癌基因功能,然而MCM3AP-AS1在胆管癌中的表达、功能及作用机制尚知之甚少。因此,本研究观察MCM3AP-AS1在胆管癌细胞中的表达及其对细胞增殖和侵袭的影响,并初步探讨机制。方法 采用qRT-PCR法检测胆管癌细胞株（CCLP、RBE、9810、HuCCT1）及人肝内胆管上皮细胞株（HIBEC）中MCM3AP-AS1的表达。将胆管癌细胞转染MCM3AP-AS1 siRNA后,以转染无义序列的胆管癌细胞为阴性对照,分别用MTT实验和Transwell实验检测细胞增殖与侵袭能力的变化,用Western blot法检测JAK/STAT3信号通路与上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达的变化;最后,用JAK/STAT3通路激动剂白血病抑制因子（LIF）行功能拯救实验验证。结果 所有胆管癌细胞系中MCM3AP-AS1表达量均明显高于HIBEC（均P<0.05）。与阴性对照组比较,CCLP细胞转染MCM3AP-AS1 siRNA后增殖能力与侵袭能力均明显减弱（均P<0.05）;JAK1/2与STAT3表达量无明显变化（均P>0.05）,但p-JAK1/2与p-STAT3表达量明显降低（均P<0.05）,同时,EMT相关蛋白E-cadherin表达升高、vimentin表达降低（均P<0.05）。功能拯救实验结果显示,同时加入LIF后,MCM3AP-AS1沉默对CCLP细胞后的以上作用均被取消,与阴性对照组间差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 胆管癌细胞中MCM3AP-AS1表达上调,MCM3AP-AS1可能通过活化JAK/STAT3通路与EMT过程而促进胆管癌细胞增殖和侵袭。     

抗肝癌单链抗体融合PE38重组免疫毒素的构建、表达及纯化

目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,并对其产物作初步纯化 ,检测其对人肝癌细胞系SMMC 772 1的毒性作用 .方法 :采用基因工程原理 ,将PE38基因片段亚克隆入hscFv表达载体 pGEX 4T 1中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ;转化大肠杆菌JM10 9后 ,受IPTG诱导表达GST融合蛋白 ,产物包涵体经变性、复性及重折叠并经GST亲合层析柱层析、凝血酶消化后 ,得到纯化的hscFv PE38融合蛋白 .采用MTT法检测hscFv PE38对SMMC772 1的杀伤作用 .结果 :实验成功构建了免疫毒素表达载体pGEX 4T 1 hscFv PE38(以下简称pGEXh PE38) ;诱导产物主要以包涵体形式存在 ,表达量为 11% ;纯化的hscFv PE38对SMMC 772 1细胞系具有较明显的杀伤作用 ,最大杀伤率为78% ,IC50 为 0 .386mg·L-1.结论 :人源化抗肝癌单链抗体与PE38重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果 ,为进一步肝癌的导向治疗提供依据     

基层医院腹腔镜胆囊切除术中预防胆管损伤的体会

我院自１９９６年９月开展腹腔镜胆囊切除术以来,已完成３００例,无一例胆管损伤,现就其体会报告如下。１　腹腔镜胆囊切除术胆管损伤最常见的原因［１］１．１　Ｃａｌｏｔ三角区粘连严重,解剖不清,胆囊周围结缔组织增生或组织水肿及粘连,导致分离三角区困难,误将肝外胆管当成胆囊管而损伤。１．２　术中因用电凝分离切割钩误伤胆总管或肝总管。１．３　因与肝管粘连,强行分离损伤肝总管。１．４　因切割胆囊或切断胆囊管时钛夹导电致胆囊管及肝总管坏死,或钛夹接触到肝管而因导电灼伤,术后渐坏死穿孔。１．５　胆管解剖变异,误…     

肝癌患者血浆RASSF1A异常甲基化检测的意义

目的:采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测41例原发性肝癌(HCC)患者血浆中游离Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)异常高甲基化情况,探讨血浆RASSF1A检测在肝癌诊断中的意义. 方法:收集患者血浆,提取游离DNA,亚硫酸氢钠修饰并纯化,以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR. 结果: 41例患者血浆中有17例RASSF1A呈现异常高甲基化(41.5%),对照血浆均为阴性. 患者一般情况、临床病理资料等与血浆中RASSF1A异常高甲基化检测结果无关(P＞0.05);在10例AFP阴性的HCC患者中,有7例结果为阳性. 结论:血浆RASSF1A甲基化检测对肝癌的早期诊断及筛选有重要意义,并有助于判断预后.     

原发性肝癌组织RASSF1A异常甲基化与DNMTs及HBV的关系

目的探讨原发性肝癌ras相关结构域家族1A（ras association domain family 1A,RASSF1A）异常甲基化与肿瘤组织中DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）转录水平变化及HBV感染的关系.方法采用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）技术检测61例原发性肝癌组织RASSF1A基因异常甲基化情况,RT-PCR法检测其中三种主要DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）水平的变化.结果61例肝癌标本中RASSF1A基因启动子区异常甲基化45例（73.8%）;HBV感染者47例（77.1%）,其中MSP阳性32例;无HBV感染者14例,其中MSP阳性13例,RASSF1A基因异常甲基化与HBV感染之间的关系无统计学意义（x2=2.260,P=0.133）.肝癌组、肝癌细胞系组及HBV感染组DNMTs表达水平与正常对照组相比均显著升高;组内比较显示肝癌组中DNMT3A、DNMT3B在MSP阳性患者中较阴性患者升高（分别为t=3.494,P＜0.01;t=4.258,P＜0.01）,而DNMT1下降（t=3.221,P＜0.05）;HBV感染组中,MSP阳性组织其DNMT3B较阴性者升高（t=12.171,P＜0.01）.结论肝癌组织DNMTs水平变化与RASSF1A异常甲基化有密切关系;HBV感染与DNMT3B转录水平变化相关.     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。