用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.     

苹果皮提取物及有效成分C3G对小鼠乳腺恶性肿瘤生长的影响

目的 探讨苹果皮提取物及其有效成分矢车菊-3-葡萄糖苷( C3G)对乳腺恶性肿瘤生长的影响. 方法 建立E0771小鼠乳腺癌移植瘤模型,观察饮用苹果皮汁对小鼠乳腺恶性肿瘤生长的影响. 免疫组化法分析饮用苹果皮汁与饮用普通无菌水组小鼠恶性肿瘤组织中 CD31 表达差异.HPLC法分析苹果皮提取物中的化学成分. 3D Matrigel胶血管形成实验探讨苹果皮成分C3 G对小鼠乳腺恶性肿瘤血管形成的影响. MTT法和Transwell实验观察C3G对血管内皮细胞SVEC增殖和迁移能力的影响. 结果 饮用含有1%和2%浓度的苹果皮汁无菌水对乳腺恶性肿瘤生长起到抑制作用. 免疫组化法染色显示饮用苹果皮汁肿瘤中CD31 表达低于未饮用苹果皮汁组. HPLC法分析显示C3G是苹果皮提取物的有效成分之一. 3D Matrige 胶实验显示C3G抑制小鼠乳腺癌细胞E0771血管生成. C3G血管形成抑制小鼠内皮细胞SVEC的迁移能力. 结论 苹果皮提取物及其有效成分C3 G抑制小鼠乳腺癌生长,该作用可能通过抑制血管生成而实现.     

miR-205慢病毒表达载体的构建及其对乳腺癌细胞作用的初步研究

目的 构建micoRNA-205(miR-205)慢病毒表达载体,感染乳腺癌细胞MB231,建立稳定表达miR-205的MB231细胞株,观察其增殖能力的变化.方法 酶切慢病毒载体GV369,设计并合成miR-205引物,通过PCR扩增目的基因连接到慢病毒载体上.对重组质粒双酶切鉴定,进行慢病毒hsa-miR-205的包装和滴度测定.用构建好的慢病毒感染MB231细胞,定量PCR检测细胞中miR-205表达水平的变化,MTT和划痕实验观察过表达miR-205后MB231细胞增殖和迁移能力的变化.结果 测序显示,目的基因连接慢病毒载体成功.慢病毒稳定感染了MB231,定量PCR结果显示,感染hsa-miR-205的MB231中miR-205表达明显提高,MTT和划痕实验结果显示感染后MB231的细胞增殖和迁移能力受到抑制.结论 成功构建了miR-205慢病毒表达载体,并建立了稳定表达miR-205的细胞株MB231,显示其可能负调控乳腺癌细胞的恶性生物学行为,为后期进一步研究miR-205的功能和机制奠定了基础.