共转染CDK1、CDK2 siRNA对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响

目的 研究共转染CDK1、CDK2 siRNA同时抑制CDK1、CDK2蛋白表达对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响,探讨细胞周期主要调控分子在肿瘤细胞凋亡中的作用.方法 以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,用脂质体lipofectamine2000同时转染CDK1 和CDK2 siRNA.在转染后48、60 h收集细胞,用Western印迹检测CDK1、CDK2蛋白的表达,AnnexinV/PI检测转染细胞的凋亡,流式细胞术DNA含量检测分析细胞周期.转染细胞进行瑞氏-姬姆萨染色(Wright-Giemsa)后在显微镜下观察其形态变化.结果 共转染CDK1、CDK2 siRNA后48和60 h,Western 印迹结果显示CDK1和CDK2蛋白的表达都同时降低.共转染CDK1、CDK2 siRNA后,细胞周期S期和G2/M期比例与对照相比有明显增加;共转染细胞经瑞氏-姬姆萨染色后在显微镜下可见双核或多核细胞增多;AnnexinV/PI检测结果显示共转染CDK1、CDK2 siRNA的细胞在48和60 h细胞凋亡率与对照相比有显著的升高.结论 siRNA 干扰导致的CDK1、CDK2表达同时降低不仅导致细胞周期S期和G2/M期的阻滞,也诱导了肿瘤细胞的凋亡.     

胃肠道肿瘤发展过程中细胞竞争作用的研究

目的 研究细胞竞争在临床肿瘤病例发生发展中的作用及可能存在的机制.方法 收集手术切除的胃肠道肿瘤标本中的肿瘤组织细胞、肿瘤旁组织细胞及远离肿瘤的正常组织细胞,应用流式细胞术检测各部位细胞增殖与凋亡率,并用Western blot检测相应部位组织C-myc蛋白的表达水平.用统计学方法分析各组之间的差异.结果 肿瘤组织的细胞增殖水平明显高于瘤旁组织细胞的增殖水平,瘤旁组织细胞的凋亡率高于肿瘤细胞,也高于远处正常组织细胞.肿瘤组织的C-myc蛋白表达水平明显高于瘤旁组织.结论 肿瘤细胞与瘤旁组织的细胞存在细胞竞争,细胞竞争在肿瘤向周围浸润侵犯过程中起到重要作用.     

一种新的双向电泳蛋白样品制备方法

目的探讨双向凝胶电泳（2-DE）样品裂解液对蛋白质分离和双向凝胶电泳结果的影响。方法以MOLT-4细胞为例，采用3种溶解性能不同的裂解液提取细胞中的蛋白质组，并分别进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果通过对2-DPAGE图谱的比较分析，发现采用8mol／L Urea，2mol／L Thiourea，4％CHAPS，1％NP-40.4％Triton X-100，65mmol／LDTT，0．5mmol／LPMSF，0．5％pharmalyte3-10，能获得质量较高的2-DE图谱。结论采用高浓度脲、三去污裂解液有利于获得优质的蛋白质样品，从而提高蛋白质提取率和双向电泳分辨率等。     

Construction and Expression of Eukaryotic Expressing Vector pCH510 of Polypeptide CH50 and Its Chemotaxis and Antitumor Function by in vivo Transfection

Fibronectin ( FN) is a high- molecular glycopro-tein with multiple- domain.FN fragments containingCell domain are chemotactic to macrophages[1] .CH5 0 polypeptide,a recombinant polypeptide weproduced by the recombination of Cell and Hep domains of human fibronectin and expression in E.coli,can activate macrophages and inhibitthe metas-tasis of tumors[2 -4 ] .To investigate the function ofCH5 0 expressed in vivo by gene transfection,explorethe feasibility of applying the polypeptide to gene…     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的 构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5α;筛选出重组质粒pAdTrack-CMV- HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pAd-HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad-HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT-PCR、Western 印迹鉴定外源基因HAX1的表达.BrdU检测感染了Ad-HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况.结果 pAdTrack-CMV-HAX1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-HAX1 质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符.构建好的Ad-HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达.HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高.结论 成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖.     

鼠源TRAIL真核表达质粒的构建及其抑瘤效应的初步观察

采用RT-PCR自小鼠脾细胞RNA中扩增出鼠TRAIL基因的全长cDNA，利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1中获得重组质粒pX1。经酶切鉴定及序列分析，表明成功构建TRAIL的真核表达质粒。通过直接肌肉内注射进行基因转染，pX1具有诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌生长的作用。表明TRAIL可作为一种直接杀伤机制应用于肝癌的基因治疗。     

紫杉醇诱导人类原代胃癌细胞凋亡及其与细胞周期关系的研究

目的 探讨紫杉醇作用于人的胃癌实体瘤的机制,为紫杉醇应用于胃癌化疗提供相应的实验室依据.方法 应用流式细胞术的AnnexinV/PI技术检测紫杉醇诱导的37例人胃癌原代细胞凋亡;Sub-G1方法分析细胞周期及检测晚期凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;Confocal检测凋亡发生的形态.结果 AnnexinV/PI法和Sub-G1法均能检测到不同浓度紫杉醇在不同时间诱导的胃癌细胞凋亡,同一浓度在不同时间诱导的胃癌细胞凋亡与对照相比差异均有显著性意义(均P<0.01);周期分布图可发现紫杉醇作用12 h出现明显的G1期细胞减少,而S和G2/M期细胞增多;25.50 μg/ml药物作用12和24 h琼脂糖凝胶电泳均可见典型的梯形改变;共聚焦显微成像可见紫杉醇诱导的人胃癌细胞的典型早期和晚期凋亡图像.结论 紫杉醇能诱导人胃癌细胞凋亡可能是其对胃癌化疗有效的机制之一.     

乳腺导管内乳头状瘤的手术治疗分析：附83例报告

目的：探讨乳腺导管内乳头状瘤乳晕旁弧形切口和劈开半乳头放射状切口2种手术方法的优缺点。 方法：回顾性分析应用乳腺纤维导管镜下行美兰定位后,经手术和病理证实的乳腺导管内乳头状瘤83例的临床资料。其中48例采用乳晕旁弧形切口,35例采用劈开半乳头放射状切口。 结果：乳腺纤维导管镜确定病变象限应用美兰染色后行乳腺区段切除,根据实际情况选用乳晕旁弧形切口和劈开半乳头放射状切口2种切口均能安全、准确切除病灶,效果良好,经6个月至2年的随访,无复发病例,切口美观。 结论：乳腺纤维导管镜结合美兰染色定位手术切除病灶是治疗乳腺导管内乳头状瘤的有效方法。2种切口均适宜,各有优缺点。     

CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用

目的 研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响,探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用,揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制.方法 以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,脂质体转染CDK1 siRNA,转染后48 h加紫杉醇(Taxol) (20 μg/ml)刺激凋亡,Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达,AnnexinV/PI法检测细胞的凋亡,流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期.结果 转染CDK1 siRNA后,CDK1蛋白的表达下降,细胞周期G2/M期比例增加,细胞凋亡率与对照相比没有明显升高.只加Taxol刺激12 h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2/M期比例增加. 转染CDK1 siRNA后再用Taxol刺激,其细胞凋亡率没有明显改变,G2/M期阻滞效应也没有叠加.BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降,与CDK1表达减少没有相关性.结论 siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2/M期阻滞,没有引起细胞凋亡;CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响.     

流式细胞术的凋亡检测技术在人胃肠实体瘤药敏试验中的应用

目的化疗药能诱导肿瘤细胞凋亡，据此将流式细胞术的经典凋亡检测技术应用到临床特异性抗肿瘤药物的筛查，实现快速，准确的药物敏感性报告。方法应用流式细胞术的AnnexinV／PI技术，检测67例临床手术切除的胃肠肿瘤在不同化疗药物诱导下发生的凋亡。结果7种化疗药物诱导的胃肠肿瘤凋亡率有显著差异，胃癌的凋亡率以紫杉醇，丝裂霉素，氟尿嘧啶最高；而大肠癌以氟尿嘧啶，丝裂霉素，奥沙利铂诱导的凋亡率最高。联合化疗方案，胃癌以氟尿嘧啶联合紫杉醇的敏感率及凋亡率最高；大肠癌以氟尿嘧啶联合奥沙利铂的敏感率及凋亡率最高。结论不同肿瘤或同一肿瘤的不同个体，对化疗药物的敏感性均不同。临床可应用凋亡检测技术作为快速的药物敏感性检测方法，为肿瘤化疗筛选合适的个体化有效方案，避免无效化疗。