早期有丝分裂抑制因子1对DNA损伤后人乳头瘤病毒16亚型E7基因介导的DNA重复复制的调控作用

目的 探索DNA损伤后人乳头瘤病毒16亚型E7致癌基因(HPV-16 E7)引起的DNA重复复制的分子机制。方法 首先在稳定表达HPV-16 E7的RPE1 E7细胞及对照空载细胞RPE1 Vector中利用流式细胞术检测DNA损伤前后细胞周期改变情况;然后利用免疫印迹检测DNA损伤前后早期有丝分裂抑制物1(Emi1)在RPE1 E7及RPE1 Vector细胞中的蛋白表达水平;最后在DNA损伤后的RPE1 E7细胞中利用小干扰RNA干扰Emi1的表达后,通过流式细胞术检测细胞多倍体的比例变化。结果 与对照细胞相比,DNA损伤后的RPE1 E7细胞中多倍体比例显著增高(t=6.397,P=0.0031);在DNA损伤后的RPE1 E7细胞中Emi1的蛋白表达水平显著增高(t=8.241,P=0.0012);在DNA损伤后的RPE1 E7细胞中应用2条独立的小干扰RNA干扰Emi1的表达后,多倍体细胞比例均显著降低(t=2.916,P=0.0434;t=3.452,P=0.0260)。结论 DNA损伤后HPV-16 E7可通过 Emi1介导DNA重复复制。     

人黄体期卵母细胞的体外成熟及玻璃化冷冻的实验研究

目的:探讨未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)技术联合玻璃化冷冻保存黄体期卵母细胞对某些女性肿瘤患者的生育能力的保存情况。方法:采集因妇科肿瘤等行卵巢切除手术过程中穿刺获取的256枚未成熟卵母细胞,按取卵时患者的月经周期分为卵泡期组(143枚)与黄体期组(113枚),每组再随即分为新鲜对照组及玻璃化冷冻组。分别进行IVM后行新鲜卵胞质内单精子注射(ICSI)授精和玻璃化冻融卵ICSI授精,比较各组间IVM后MII卵率、受精率、卵裂率、优质胚胎率。结果:①卵泡期与黄体期卵母细胞的IVM率差异无统计学意义;而组间复苏存活率(68.0%vs 48.1%)有统计学差异(P<0.05);卵泡期与黄体期卵母细胞新鲜组间受精率、卵裂率、优质胚胎率无统计学差异,冷冻组间差异亦无统计学意义。②与新鲜组相比,玻璃化冷冻使卵泡期与黄体期卵母细胞的受精率均降低(P<0.01)。结论:黄体期未成熟卵母细胞可以体外成熟并有继续发育为优质胚胎的能力;玻璃化冷冻使卵母细胞受精率、卵裂率下降。IVM和冻融后体外授精是某些女性肿瘤患者保存生育能力的一种有临床应用前景的方式。     

GRIM-19在小鼠植入前胚胎中的表达及其作用

目的 通过研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因 (GRIM-19)在小鼠植入前胚胎中的表达及其与胚胎质量之间的相关性,探讨GRIM-19在小鼠植入前胚胎发育中的作用。方法 采用实时定量PCR,检测小鼠植入前胚胎（2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚和囊胚）中GRIM-19 mRNA水平 (n =16);将小鼠8 细胞期胚胎按卵裂球大小、形态、透明带、胞质碎片分为优胚组和非优胚组,分别检测两组胚胎GRIM-19 mRNA水平,并分析其相关性 (n =13);制作假孕鼠（23只）,并随机分为A组（12只）和B组（11只）,采用移植器将优质和非优质8-细胞期胚胎移入假孕鼠的子宫内,观察两组雌鼠妊娠率及产仔率。结果 GRIM-19在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其mRNA水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势。优质8-细胞胚胎的GRIM-19 mRNA水平明显高于非优胚组（P <0.05）。两组8-细胞胚胎移植后,A组雌鼠妊娠率及产仔率显著高于B组雌鼠（P<0.05）。 结论 小鼠植入前胚胎中GRIM-19的表达量随发育时程的改变而变化,且与胚胎质量密切相关。     

GRIM-19在胚胎停育患者绒毛组织中表达及其作用机制的研究

目的:探讨干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(gene associated with retinoidinterferon-induced mortality-19,GRIM-19)与胚胎停育的关系及作用机制。方法:选择50例胚胎停育患者为实验组,50例非意愿妊娠要求行人工流产的正常早孕患者为对照组。用免疫组织化学法对绒毛组织中GRIM-19进行定位检测;采用Western blotting和Real-time PCR检测绒毛组织中GRIM-19蛋白和mRNA水平。应用荧光探针JC-1测定绒毛细胞线粒体跨膜电位,AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡率。采用GRIM-19-siRNA转染技术使HTR-8/SVneo细胞低表达GRIM-19,并测定转染后细胞线粒体跨膜电位与细胞凋亡率。结果:GRIM-19在所有患者绒毛中均有不同程度的表达,与对照组相比,实验组绒毛中GRIM-19蛋白和mRNA的表达量降低,差异有统计学意义(P0.01)。实验组绒毛细胞线粒体膜电位较对照组降低,细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。转染后HTR-8/SVneo细胞线粒体膜电位明显降低、细胞凋亡率升高,较转染前均有统计学差异(P0.05),且线粒体膜电位与细胞凋亡率之间存在着明显的负相关性(r=-0.754,P0.01)。结论:GRIM-19在早期妊娠中起重要作用,而GRIM-19的低表达可能通过影响线粒体功能,增加细胞凋亡参与了胚胎停育的发生、发展。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对小鼠胚胎冷冻保护的作用

目的将抗冷冻蛋白III(AFPIII)应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1 200枚,随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组(AFPIII终浓度为500 ng/mL),每组400枚,其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养,200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色,比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05);新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。