自噬在EGFR-TKI类肿瘤靶向药物对肺癌的治疗和耐药中作用的研究进展

表皮生长因子受体激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）是一类针对肿瘤细胞中EGFR的异常活化而开发的肿瘤靶向药物,可以有效抑制带有EGFR敏感突变的肿瘤细胞的生长。然而先天性以及获得性耐药严重制约了该类药物的使用。近些年的研究发现自噬（autophagy）,作为一个细胞编码的高度保守的应对压力的存活机制,其与肿瘤的发生发展及抗肿瘤药物的耐药密切相关。EGFR的激活可以通过多条通路调控自噬。EGFR-TKI也可以诱导自噬,且自噬在EGFR-TKI的治疗和产生耐药性的过程中发挥着双刃剑的作用：一方面EGFR-TKI诱导的自噬是肿瘤细胞的一个保护机制,联合使用自噬抑制剂可以增强药物的细胞毒性效果;同时还有研究证明EGFR-TKI诱导的高水平自噬可以在凋亡缺陷的细胞中造成自噬性死亡,这种情况下联合使用自噬诱导剂则可能产生更好的效果。因此,针对不同的情况通过调控自噬以提高EGFR-TKI的治疗效果是一个颇具前景的治疗方案。本文对EGFR-TKI和自噬相关的信号通路进行了阐述,并对自噬在EGFR-TKI类药物对肺癌的治疗和耐药中作用的最新研究进展进行了总结,为设计联合方案提高EGFR-TKI的抑制效果,降低耐药性提供线索。     

miR-101通过靶向FGF2抑制非小细胞肺癌的迁移和侵袭

目的：探究microRNA-101 (miR-101)通过靶向成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）抑制非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞迁移和侵袭的分子机制。方法：采用qPCR法检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞系A549、H661和SK-MES-1，以及转染后A549细胞miR-101和FGF2的表达水平。分别将miR-NC、miR-101 mimics、miR-IN-NC、miR-101 inhibitor或pcDNA-3.1空质粒、pcDNA-FGF2转染至A549细胞，运用划痕愈合实验和Transwell小室实验，检测A549细胞中过表达miR-101和FGF2对NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响，采用Western blotting（WB）法检测各组A549细胞中FGF2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平。结果：miR-101在NSCLC细胞系中的表达水平明显低于正常肺上皮细胞（均P<0.05），而以A549细胞中表达水平为最低。过表达miR-101可明显抑制A549细胞的迁移（P<0.05）和侵袭（P<0.01），且使细胞中E-cadherin的表达增多（P<0.05）而Vimentin（P<0.05）、N-cadherin（P<0.01）和p-ERK1/2（P<0.05）的表达水平降低。抑制miR-101表达后，可以显著增强A549细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.05），引起细胞中E-cadherin表达明显降低而 Vimentin、N-cadherin 和 p-ERK1/2 表达水平增高（均 P<0.05）。采用 WB 法和双荧光素酶报告基因实验验证了 FGF2 是miR-101的直接靶基因，且过表达FGF2后显著增强A549细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.01），以及减少细胞中E-cadherin的表达（P<0.01）而增加Vimentin（P<0.01）、N-cadherin（P<0.05）和p-ERK1/2（P<0.05）表达水平。与单独过表达FGF2组相比，共同过表达miR-101和FGF2组A549细胞迁移和侵袭能力明显减弱（均P<0.01），其E-cadherin的表达增多（P<0.01）而Vimentin（P<0.01）、N-cadherin（P<0.05）和p-ERK1/2表达水平下降（P<0.01）。结论：miR-101通过调控靶基因FGF2抑制NSCLC A549细胞的上皮间质转化（EMT）过程及ERK信号通路，进而抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭。     

HIV-1疫苗prime-boost策略免疫间隔研究

目的探索不同的DNA、重组痘苗病毒、蛋白疫苗免疫间隔在HIV-1疫苗prime-boost策略中对免疫效果的影响,为建立最佳免疫方案提供理论支持。方法对小鼠进行3针DNA初免,之后分别间隔3周、6周、12周、16周免疫重组痘苗病毒VTKgpe;对小鼠或兔子进行3针DNA初免,间隔16周免疫VTKgpe,之后分别间隔4周或8周免疫gp140蛋白。末次免疫后2周检测HIV-1特异性体液或细胞免疫应答。结果 DNA初免-VTKgpe加强间隔16周效果最佳,诱导的HIV-1 Env特异性抗体滴度达到105,分泌IFN-γ的T细胞数为5 966.4/106细胞。DNA初免,间隔16周VTKgpe加强,之后间隔4周或8周gp140蛋白加强效果差异无统计学意义。结论 DNA疫苗初免,16周后VTKgpe加强,4周后gp140蛋白加强可诱导较高的免疫应答,同时更为适宜临床试验及商业化应用的需要。     

HIV-1膜蛋白gp140三聚体的真核表达、纯化、鉴定

摘要：目的构建表达中国流行株HIvl-1cRF_07B／C亚型（CN54）膜蛋白gpl40及其突变体,为HIV-1疫苗设计提供优秀的免疫原。方法构建gpl40、gpl40ST质粒,将质粒瞬时转染293F细胞,120h后收获上清液,经纯化、浓缩、PBS置换后,利用SDS-PAGE电泳、Western-blot检测蛋白的表达,ELISA检测其与HIV-1阳性病人血清的反应性。结果SDS-PAGE电泳、Western-blot试验证明成功表达了gpl40、gpl40ST蛋白,并且gpl40ST是-个稳定的三聚体蛋白质。ELISA试验检测,发现表达的gpl40ST蛋白与HIV-1阳性病人血清的亲和力高于gpl40蛋白。结论经过突变改造的gpl40ST具有稳定的三聚体构象,可作为HIV-1免疫原进行疫苗研究。     

缺失C8-K3片段重组天坛痘苗病毒的免疫策略研究

目的探索不同的DNA疫苗初免-重组痘苗病毒加强免疫策略的效果,为建立最佳免疫方案提供依据。方法对小鼠进行DNA疫苗初免,之后分别加强免疫一针、两针和三针重组痘苗病毒VTT△C8-K3-gag,在不同时间点采取血样及制备脾细胞,检测针对痘苗病毒和HIV特异性体液免疫及细胞免疫应答。结果三种免疫策略中,DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两次的效果最佳,诱导的针对p55的结合抗体滴度达到106,分泌IFN-γ的T细胞数为342/106细胞。针对痘苗病毒的体液和细胞免疫应答显著低于加强免疫三针诱导的免疫反应。结论DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两针可诱导较高水平的HIV免疫应答,同时保证了较低水平的载体免疫反应。