基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统构建北大核心CSCD

目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。     

肺炎链球菌HMG-CoA合成酶基因克隆和表达

目的 克隆、表达肺炎链球菌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase, HMGS).方法 采用基因工程技术克隆肺炎链球菌HMGS基因,对T226进行反突变,构建重组表达载体pET-HMGSm并表达HMGS.结果 序列分析表明该基因与文献中报道的肺炎链球菌HMGS基因(No.AF290098)相比较有98.5%的同源性,存在18个核苷酸的差异,其中有2个核苷酸的不同导致编码的氨基酸改变,分别是Asn259→Ser,Ala349→Val,该基因编码蛋白由398个氨基酸组成.结论 优化重组HMGS表达条件,在18 ℃ 0.4 mmol/L IPTG诱导表达4 h,用Ni-NTA层析柱分离纯化得到46 kDa特异性蛋白.     

幽门螺杆菌6S RNA敲除菌株构建及对细胞毒性的影响

目的 构建幽门螺杆菌6S RNA基因敲除菌株,研究6S RNA敲除后对细菌生长及细胞毒力的影响。方法 以幽门螺杆菌6S RNA基因为靶基因,构建6S RNA敲除质粒;利用电转法转化幽门螺杆菌,利用同源重组机制构建6S RNA敲除菌株;分析6S RNA敲除对细菌生长及细胞毒性的影响。结果 成功构建幽门螺杆菌6S RNA基因敲除菌株,与野生型菌株相比,敲除菌株的生长方式显著改变,对GES-1胃粘膜上皮细胞的毒性显著降低。结论 6S RNA具有调控幽门螺杆菌生长及毒力相关因子的功能,为幽门螺杆菌生物学功能及转录调控机制研究奠定了基础。     

胃内尿素酶阳性细菌对幽门螺杆菌感染诊断的影响

目的探讨胃内可分解尿素酶菌群对基于尿素酶阳性诊断幽门螺杆菌(Helicobacter.pylori,Hp)感染的影响。方法胃镜下取疑为Hp感染患者的胃黏膜,行快速尿素酶检测(Rapid urease test,RUT)及细菌培养,根据培养物的菌落形态、革兰染色、RUT及Hp特异性16SrRNA基因片段PCR进行Hp的鉴定;提取胃黏膜组织DNA,通过Hp特异性PCR进行Hp感染快速诊断。对Hp阴性(Hp培养或特异性PCR阴性)而RUT阳性胃黏膜培养的非Hp(nonHp)进行常规尿素酶生化试验,选取20株尿素酶阳性non-Hp利用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增并测序,利用NCBI系统进行序列比对,鉴定细菌种类。结果 606例患者胃黏膜RUT阳性率为58.4%(354/606),Hp培养阳性率29.7%(180/606)。Hp培养阴性胃黏膜特异性PCR阳性113例,Hp感染率为48.35%(293/606)。胃黏膜RUT阳性率高于胃黏膜Hp感染(χ2=1,2.337,P0.05)。61例RUT阳性Hp培养或特异性PCR阴性的胃黏膜培养出80株non-Hp,其常规尿素酶生化检查均阳性。对其中20株尿素酶阳性non-Hp进行测序鉴定,均为产尿素酶菌。结论胃内存在除Hp外其他细菌,包括尿素酶阳性non-Hp,可造成RUT阳性,干扰Hp感染的实验诊断。     

贵阳地区351株幽门螺杆菌药物敏感性及pbp1多样性分析

目的 了解贵阳地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)对5种抗生素药物敏感性及阿莫西林耐药菌株pbp1突变特征。方法 采用界值法检测351株幽门螺杆菌临床菌株对5种抗菌药物的敏感性,对各药物耐药率以χ²检验进行比较。选取20株阿莫西林耐药菌株及相等数量的敏感菌株,提取基因组DNA,PCR扩增pbp1基因功能区并测序,采用DNAStar软件将核苷酸序列转换为氨基酸序列后进行比对和分析。结果 351株幽门螺杆菌临床菌株对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星和四环素5种药物的耐药率分别为71.56%、34.60%、13.27%、40.28%、17.06%。20株阿莫西林耐药和20株敏感菌株PBP1氨基酸序列分析结果显示,PBP1多样性复杂,在耐药菌株特有变异位点中,PBP1氨基酸的S543R变异频率最高,为75%,其次是N641D为60%。结论 本研究中的幽门螺杆菌对5种抗生素均有不同程度耐药,其中阿莫西林和四环素耐药率较其他地区高,并且双重耐药与多重耐药在总体耐药中所占比例较大; 阿莫西林耐药菌株PBP1氨基酸存在多位点多态性,可能与幽门螺杆菌阿莫西林耐药有关。     

肺炎链球菌HMG-CoA合成酶动力学研究

目的：在克隆表达肺炎链球菌HMG-CoA合成酶（HMGS）的基础上,对HMGS进行动力学研究。方法：采用紫外分光光度法,以乙酰-CoA作为底物,检测乙酰乙酰-CoA在300 nm处吸收值的变化。结果：肺炎链球菌HMGS的最适pH 9.75、最适温度37℃、最适MgCl2浓度为10 mol/L,粗酶提取物的比活为0.76μmol/min·mg^-1,分离纯化后的比活为3.24μmol/min·mg^-1,比活提高4.26倍。结论：在37℃、pH 9.755、mol/L MgCl2的最适反应条件下,肺炎链球菌HMGS的Vmax和Km值分别为4.69μmol/min·mg^-1和213μmol。