hsa-miR-1908上游启动子区的生物信息学分析

目的利用各种生物信息学工具预测hsa-miR-1908上游启动子功能,以进一步研究其在人脂肪细胞中的转录调控机制。方法应用Ensemble数据库获取hsa-miR-1908上游启动子序列,利用多种在线相关软件预测出甲基化部位和转录因子结合部位。结果获取hsa-miR-1908上游启动子序列全长1 458 bp。miR-1908启动子序列中CpG岛位于(438~756)bp、(836~937)bp、(979~1374)bp处,CpG岛的存在会抑制miR-1908启动子的转录。miR-1908有15个转录因子的结合位点。结论 miRNA启动子相关生物信息学的研究,提高对启动子的研究效率,为进一步研究miR-1908的转录调控机制提供了重要的信息。     

肿瘤坏死因子-α对人脂肪细胞STEAP4蛋白膜转位的影响及其机制

目的 探讨肿瘤坏死因子-α (TNF-α)对人脂肪细胞STEAP4蛋白膜转位的影响,并分析其可能的机制.方法 应用1-甲基3-异丁基黄嘌呤(MIX)、地塞米松、胰岛素、罗格列酮方案诱导人前体脂肪细胞分化,以人重组TNF-α或加用细胞外信号调节蛋白激酶( ERK)抑制剂PD-98059干预人成熟脂肪细胞24 h,采用Western blot技术检测细胞膜蛋白与总蛋白中STEAP4蛋白的表达.结果TNF-α干预能显著促进人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白向细胞膜转位;ERK抑制剂PD-98059联合TNF-α与单独应用TNF-α诱导人成熟脂肪细胞的细胞膜蛋白和总蛋白中STEAP4蛋白的表达水平比较均无显著差异.结论 TNF-α干预显著促进人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的膜转位,初步排除丝裂原活化蛋白激酶信号途径参与这一调控机制.     

β-Casein-15肽在抗新生儿常见致病菌中的作用

目的 研究乳源性多肽对新生儿抗感染作用,为生命早期健康成长提供营养保障。方法 利用质谱定量技术比较β-Casein-15肽在早产和足月产产妇母乳中的含量差异;通过Uniprot、SABLE、ProtParam tool在线数据库预测β-Casein-15肽生物学特征;以抑菌圈实验以及免疫荧光实验来检测β-Casein-15肽对大肠杆菌、小肠结肠炎菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用。结果 通过质谱分析以及生物信息学分析发现β-Casein-15肽的脂肪指数是122.33,亲水性是-0.387,不稳定系数是36.29。这些数据表明β-Casein-15肽是稳定性疏水性多肽。质谱定量分析发现β-Casein-15肽在早产儿产妇母乳中含量明显高于足月儿产妇,抑菌实验发现β-Casein-15肽对大肠杆菌、小肠结肠炎菌以及金黄色葡萄球菌生长均有明显的抑制作用。结论 这些结果提示β-Casein-15肽在抗新生儿感染中发挥着重要的作用。     

人miR-146b慢病毒载体构建及人脂肪细胞中表达验证

目的 构建人miR-146b慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪细胞中过表达效果。方法 以人基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-146b区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-146b的相应表达量。结果 成功构建人miR-146b慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪细胞的效率可达到85%以上,miR-146b过表达水平可接近4倍。结论 本研究成功构建了人miR-146b慢病毒表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响

【目的】 观察NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响。 【方法】 以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4(PID1)基因(NYGGF4-pcDNA3.1 (+)/myc-His B)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体[pcDNA3.1(+)/myc-His B]的3T3-L1前体脂肪细胞为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤(MIX)加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用Real-time PCR检测线粒体代谢酶指标:己糖激酶(Hexokinase,HKI)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA,ACC)、柠檬酸合成酶( citrate synthase,CS)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(Carnitine palmitoyl-transferase 1,CPT1)、细胞色素C(Cytochrome c,Cyc-c)基因表达水平。 【结果】 NYGGF4(PID1)过表达显著降低3T3-L1脂肪细胞己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异有统计学意义。 【结论】 NYGGF4(PID1)基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4(PID1)基因过表达能影响3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢。     

不同浓度葡萄糖和游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞株L6细胞胰岛素敏感性和细胞内活性氧的影响

目的研究不同浓度的葡萄糖和游离脂肪酸（FFA）对骨骼肌L6细胞胰岛素敏感性及细胞内活性氧（ROS）的影响。方法L6细胞诱导分化成熟后,分为6组,以5mmol／L葡萄糖为低糖对照组,其中加0．3或1mmol／L的混合FFA为低糖低FFA或低糖高FFA组,以25mmol／L葡萄糖为高糖对照组,其中加0．3和1mmol／L的FFA的培养基为高糖低FFA或高糖高FFA组。干预48h,^3H—D葡萄糖摄取实验（加与不加100nmol／I,胰岛素37℃30rain）验证L6细胞胰岛素敏感性,经荧光探针H2DCFDA观察细胞内ROS含量的变化。结果在5mmol／L葡萄糖组,低糖对照组基础摄糖值为22777．6±6608．7,低糖低FFA组为26027．5±4085．7,低糖高FFA组为146805．1±21099．4。胰岛素刺激后,低糖对照组为76586．5±18450．1,低糖低FFA组为43738土9203．6,低糖高FFA组为32050．6±3362．3,较低糖对照组显著降低（P〈0．01）。在25mmol／L葡萄糖组,基础葡萄糖摄取量为11793．8±551．4,高糖低FFA组11887．3±2082．3高糖高FFA组为13886．1±3872．9,差别无统计学意义（P〉0．05）,但较低糖对照组显著降低（P〈0．01）．加入胰岛素刺激后,高糖对照组为42798．8±9441．5,高糖低FFA组为23946．9±3839．6,高糖高FFA组为13886．1±3872．9,各组之间差别显著（P〈0．01）。对细胞内R0s的研究发现,低糖低FFA组为2234．2±477．2,低糖高FFA组为1969．0±480．9,高糖对照组为1969．0土229．4,高糖低FFA组为2]84．5±734．2,高糖高FFA组为2571．3±96．7,可以显著增加的L6细胞内ROS,与低糖对照组（615．3±244．3）相比差别显著（P〈0．01）。除对照组之外的各组之间差别无统计学意义（P〉0．05）。结论高糖和高FFA可以诱导L6细胞出现氧化应激,同时高糖和高FFA是导致骨骼肌细胞胰岛素抵抗的重要原因之一。     

miR-146b靶标预测及功能分析

目的 通过对miR-146b进行系统的生物信息学分析,预测miR-146b的靶基因及其功能.方法 应用miRBase获取并分析miR-146b的序列特征;应用TargetScan、PicTar及miRanda预测miR-146b的靶基因,进行功能注释和信号转导通路分析;应用PubMed、Google等信息搜索工具综述miR-146b已有功能研究.结果 miR-146b在各物种之间具有高度保守性.功能注释显示预测靶基因主要富集于促细胞增殖、转录调控、调控细胞分化等生物学过程.信号转导通路分析显示预测靶基因显著富集于白血病、ErbB信号通路、促分裂原活化的蛋白激酶通路等.结论 生物信息学分析提示,miR-146b可能与细胞分化、代谢密切相关.     

hsa-miR-100的生物信息学分析

目的 对hsa-miR-100进行靶基因、功能预测等生物信息学分析,为深入研究hsa-miR-100功能提供理论和试验基础.方法 利用Pubmed检索miRNA-100相关文章,通过miRBase、NCBI、UCSC Browser等在线工具分析hsa-miR-100序列,应用miRanda、TargetScan及PicTar预测hsa-miR-100靶基因,结合已证实的靶基因进行功能富集分析和信号通路富集分析.结果 hsa-miR-100与多种肿瘤发生、发展有关,其序列在各物种间具有高度保守性.hsa-miR-100靶基因功能富集于基因沉默、染色质沉默、细胞生物合成负性调节等(P<0.01),涉及肿瘤信号通路、溶酶体信号通路、凋亡信号通路等信号转导通路(P<0.05).结论 hsa-miR-100可能参与肿瘤发生相关的生物学过程.     

LYRM1基因过表达对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响

目的观察LYRM1基因过表达对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响。方法体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,分别构建LYRM1基因过表达细胞株(LYRM1-pcDNA3.1/myc-His B)和空载对照细胞株(pcDNA3.1/myc-His B);实时定量RT-PCR验证转染情况;RT-PCR检测诱导分化成熟后的线粒体代谢酶HKI,ACC,CS,CPT1和Cyc-C基因表达水平。结果 RT-PCR结果证实LYRM1质粒转染成功;与空载对照组比较,LYRM1过表达组HKI,ACC,CS,CPT1和Cyc-C mRNA表达水平均显著降低(P均<0.05)。结论 LYRM1基因过表达下调了3T3-L1脂肪细胞中线粒体的代谢关键酶基因表达水平,可能参与调节脂肪细胞线粒体的代谢。     

人miR-152基因的慢病毒载体的构建及稳定株筛选

目的构建人miR-152基因重组慢病毒载体并筛选稳定表达株。方法 PCR扩增包括miR-152前体所在区域的基因组DNA,克隆到慢病毒载体表达质粒pGIPZ中,得到重组的pGIPZ-miR-152表达载体,通过与包装质粒共转染HEK-293T细胞,获得携带miR-152 minigene的重组慢病毒。用病毒感染HepG2细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选。用real-time PCR法检测miR-152基因的表达。结果构建的重组质粒经双酶切验证和测序比对鉴定正确;该质粒转染293T细胞获取的慢病毒滴度达7.5×107TU/mL;用病毒感染HepG2细胞,感染效率达70%以上。药物筛选10 d后,获得的过表达株miR-152表达量比正常细胞高近10倍。结论成功构建人miR-152基因慢病毒载体质粒pGIPZ-miR-152,并筛选出miR-152过表达细胞株,为后续实验奠定基础。