内皮抑素治疗人喉癌裸鼠模型的实验研究

目的 研究内皮抑素对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用,探讨其抑瘤机制及人喉癌生物治疗新方法。方法 建立人喉癌Hep-Ⅱ细胞株裸鼠皮下接种模型。应用内皮抑素治疗,观察肿瘤生长情况,对用药后肿瘤组织进行病理学检查,通用型二步法免疫组化检查及电镜观察。计数微血管密度(microvessel density,MVD),计算增殖细胞核抗原(proliferationg cell nuclear antigen,PCNA)和血管内皮生长因子(vascuoar endothelial growth factor,VEGF)阳性率。结果 在实验组与对照组之间,鼠净重、瘤重、瘤体积及瘤重/鼠净重,经t检验P值<0.05或<0.01,差异均有显著性意义,抑瘤率为45.9％。病理学检查及电镜观察表明,实验组应用内皮抑素治疗肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见肿瘤细胞的坏死凋亡,新生血管明显减少。MVD、PCNA及VEGF表达在实验组明显低于对照组,经t检验P值分别为<0.01、<0.05、<0.05,差异均有显著性意义。结论 内皮抑素可显著抑制人喉癌裸鼠模型肿瘤的生长和发展,其可能机制为抑制肿瘤血管生成。     

肿瘤抑素诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的探讨肿瘤抑素对体外培养的人喉癌Hep-2细胞系凋亡的影响。方法用MTT法和台盼蓝染色法观察肿瘤抑素对喉癌Hep-2细胞生长的抑制作用。实验分为对照组和治疗组．光镜、电镜观察细胞形态及超微结构变化，采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的梯形条带，TUNEL标记法检测细胞凋亡情况。结果随着肿瘤抑素浓度的增加喉癌Hep-2细胞的存活率下降。在相同浓度下。随着时间延长存活细胞逐渐减少。电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡，琼脂糖电泳结果可见治疗组产生了特征性的DNA梯形条带，TUNEL标记法也证实治疗组可见明显的棕黄色凋亡细胞。结论肿瘤抑素通过诱导凋亡对体外培养的人喉癌Hep-2细胞系产生杀伤作用。     

腺病毒介导的组织途径抑制因子2基因抑制喉鳞状细胞癌生长的实验研究

目的研究腺病毒介导的组织途径抑制因子2(tissuefactorpathwayinhibitor-2,TFPI-2)基因对喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)生长的抑制作用。方法扩增并鉴定携带人-TFPI-2的重组腺病毒(adenovirusesTFPI-2,AdTFPI-2)。建立喉鳞癌荷瘤裸鼠动物模型,治疗组9只裸鼠瘤周注射AdTFPI2的重组腺病毒2×1011空斑形成单位(plaqueformingunits,PFU)共3次,对照组9只裸鼠瘤周注射等量的空载体,观察治疗结束后1周两组肿瘤质量和体积的差异。运用透射电镜观察肿瘤形态学变化;运用免疫组化方法检测肿瘤组织中增殖核抗原的表达。结果扩增后的AdTFPI-2的病毒滴度为2.8×1012PFU/ml。AdTFPI2治疗组裸鼠肿瘤平均体积和质量分别为(1.20±0.34)cm3和(1.52±0.39)g,明显小于空载体对照组的(2.08±0.52)cm3和(2.67±0.47)g(P<0.01)。透射电镜观察到AdTFPI2治疗组肿瘤呈凋亡改变,免疫组化结果显示AdTFPI-2治疗组的增殖细胞核抗原指数(54.9%±12.4%)明显低于对照组(75.8%±11.2%,P<0.01)。结论瘤周注射携带人TFPI2的重组腺病毒可抑制裸鼠体内喉鳞癌的生长。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在喉癌中的表达

目的：探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的4个受体DR4、DR5、DcR1、DcR2在喉癌中的表达及意义。方法：应用免疫组织化学方法，检测68例喉鳞状细胞癌及40例正常喉黏膜中TRAIL的受体DR4、DR5、DcR1、DcR2的表达情况。结果：在喉癌组织及喉正常黏膜中均表达TRAIL的4个受体，其中死亡受体DR4、DR5在喉癌组织及正常喉黏膜中均呈高表达，均差异无统计学意义（均P〉0．05），而诱骗受体DcR1、DcR2在正常喉黏膜中表达较高，在喉癌组织中则表达低，均差异有统计学意义（均P〈0．05）。喉癌组织分化程度越高，则DR5表达越低，DcR2的表达越高，差异有统计学意义（P〈0．05）。而各个临床分期的癌组织中，4个受体的表达均无明显差异（均P〉0．05）。结论：喉癌组织中普遍存在着TRAIL受体的表达，并存在着受体类型表达的差异。TRAIL抑制肿瘤作用可能与基因受体DcR1、DcR2在不同组织的分布不同有关。TRAIL基因受体DR5、DcR2可能在不同病理分期喉癌的凋亡机制中发挥重要作用。     

喉癌中MT1、MT2和MT3-MMP的mRNA表达及意义

目的探讨喉癌组织中3种膜型基质金属蛋白酶(MT-MMPs)的表达与喉癌浸润转移的关系.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测24例喉癌组织和周围正常粘膜中3种膜型基质金属蛋白酶(MT1,MT2和MT3-MMP)的mRNA的表达情况,并将其结果与临床及病理学资料进行统计学分析.结果喉癌中MT1,MT2和MT3-MMP的表达显著高于癌旁组织(P＜0.01),并与喉癌的侵袭深度密切相关(P＜0.05),而与原发部位和病理分级无明显相关(P＞0.05).喉癌伴淋巴结转移者MT1-MMP的表达明显高于无淋巴结转移者(P＜0.05).结论膜型基质金属蛋白酶在喉癌的发展过程起重要作用,MT1-MMP可作为判断喉癌浸润和转移潜能的可靠指标.早期阻断MT1,MT2和MT3-MMP的表达,将可能对预防喉癌浸润转移有重要作用.     

重组人内皮抑素的表达、纯化、复性方法研究

[目的]摸索重组人内皮抑素(recombinanthumanendostatin,rhES)的最佳生产工艺路线,解决rhES在大肠杆菌中表达提取的蛋白变性问题。[方法](1)按所优化的条件进行rhES的表达,包涵体的提取、洗涤、变性、复性。(2)活性检测:观察rhES对裸鼠皮下移植瘤生长情况及病理组织学的影响。[结果](1)每升培养基可得可溶性rhES蛋白10.55mg,rhES在大肠杆菌中的表达量超过总菌体蛋白的60%,纯化后的蛋白纯度超过95%。(2)动物实验:rhES抑瘤效果显著,抑瘤率为45.86%,实验组与对照组在肿瘤体积、重量、裸鼠除瘤净重、瘤重/鼠净重4个指标上均有显著性差异(P<0.01)。光镜见实验组微血管密度降低,坏死面积增加,电镜见实验组凋亡细胞增加。[结论]本实验所优化的生产工艺路线可获得可溶性的、高纯度、高活性的rhES蛋白,解决了rhES在大肠杆菌中提取时的蛋白变性问题。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导喉癌凋亡的实验研究

目的:研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导喉鳞状细胞癌Hep-2细胞凋亡的作用机制。方法:应用不同浓度的TRAIL作用于喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,应用噻唑蓝比色法绘制细胞的生长曲线,计算生长抑制率;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;应用透射电镜观察细胞的微观形态学改变。结果:TRAIL能抑制体外培养的喉癌Hep-2细胞生长,其抑制作用存在着明显的浓度依赖性,随着TRAIL浓度的不断增加,喉癌Hep-2细胞的生长抑制率也增加,经TRAIL(100μg/L)处理24h,喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长抑制率达到(62.75±1.00)%。流式细胞仪检测结果显示喉鳞状细胞癌Hep-2细胞凋亡发生率随TRAIL浓度增加而明显增加,在TRAIL浓度为1、10、100μg/L时凋亡发生率分别为(11.49±0.36)%、(22.31±0.82)%和(59.64±1.10)%,与对照组凋亡发生率为(3.13±0.12)%相比,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。透射电镜观察发现,应用100μg/L TRAIL处理后的Hep-2细胞发生凋亡改变,可见细胞出现核碎裂,核仁消失,染色质固缩,电子密度增高,线粒体肿胀...     

靶向生存素siRNA抑制人喉鳞癌裸鼠动物模型的实验研究

目的 研究靶向生存素siRNA对喉鳞癌动物模型的抑制作用,探讨其可能的抑瘤机制.方法 建立人喉鳞癌裸鼠移植瘤模型,将33只裸鼠随机分为3组,对照组瘤体内注射PBS液,空载体组瘤体内注射空慢病毒载体(Ad-control),治疗组应用生存素siRNA (Ad-survivin)进行瘤内注射治疗,观察各组肿瘤生长情况,光镜及透射电镜观察肿瘤超微结构变化,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测Bcl-2蛋白的表达情况.结果 治疗组体内注射生存素siRNA(100 ng·mL-1·d-1),裸鼠肿瘤生长受到明显抑制,与对照组及空载体组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).光镜、电镜下观察到治疗组肿瘤组织发生坏死和凋亡改变,Tunel证实治疗组肿瘤细胞凋亡数目明显增多,与对照组及空慢病毒组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),免疫组化示治疗组Bcl-2表达下降.结论 生存素siRNA抑制喉鳞癌裸鼠生长,其作用机制可能与抑制Bcl-2表达诱导肿瘤细胞凋亡相关.