C-erbB-2 shRNA对小鼠肺腺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制

目的：探讨人表皮生长因子受体2短发夹RNA(C-erbB-2 shRNA)对小鼠肺腺癌Lewis细胞化疗敏感性的影响及其机制，为非小细胞肺癌尤其是腺癌的治疗提供新的思路。方法：常规培养小鼠肺腺癌Lewis细胞，分为未转染组、pGPU6/RFP/Neo-shNC组和pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组；应用Lipofectamine 2000将质粒快速转染各组Lewis细胞；应用RT-PCR法检测各组细胞C-erbB-2 mRNA表达水平；应用Western blottting法检测各组细胞C-erbB-2蛋白表达水平。将Lewis细胞分为未转染对照组、pGPU6/RFP/Neo-shNC组、卡铂组、pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组、pGPU6/RFP/Neo-erbB-2+卡铂组和pGPU6/RFP/Neo-shNC + 卡铂组；应用流式细胞术检测各组细胞凋亡率；应用Western blotting法检测各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果：pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组C-erbB-2 mRNA和蛋白表达水平均低于未转染组和pGPU6/RFP/Neo-shNC组；pGPU6/RFP/Neo-erbB-2+卡铂组细胞凋亡率高于其他各组（P<0.01）；与其他各组比较，pGPU6/RFP/Neo-erbB-2 + 卡铂组Bcl-2蛋白表达水平下降、Bax蛋白表达水平增加。结论：C-erbB-2 shRNA能增强小鼠肺腺癌Lewis细胞对卡铂的敏感性，其机制可能是通过上调Bax蛋白、下调Bcl-2蛋白表达，进而增强卡铂诱导的细胞凋亡。     

黄芩素通过抑制ERK通路下调HeLa细胞中基质金属蛋白酶的表达

目的观察不同浓度黄芩素处理宫颈癌细胞后,细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)与基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9 mRNA及蛋白水平表达的变化。方法体外培养HeLa细胞株,分为空白对照组、100μmol/L、200μmol/L黄芩素处理组,培养24 h。明胶酶谱法检测上清液中MMP-2、MMP-9的活性变化。反转录PCR法检测ERK1/2及MMP-2、MMP-9的mRNA水平的表达变化。Western blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2及MMP-2、MMP-9的蛋白水平的表达变化。结果黄芩素处理24 h后,与空白对照组相比较,MMP-2、MMP-9的活性变化逐渐降低,且呈浓度依赖性(P0.05)。ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达随着黄芩素浓度的增强逐渐降低(P0.05)。结论黄芩素通过激活ERK1/2信号通路下调MMP-2、MMP-9的表达。     

黄芩素抑制宫颈癌HeLa细胞迁移作用机制的研究

目的：观察不同浓度黄芩素干预宫颈癌HeLa细胞后,细胞迁移、细胞培养基中基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase,MMP9）活性的变化,以及MMP2、MMP9 mRNA和蛋白表达水平的变化。方法：体外培养宫颈癌HeLa细胞,分空白对照（Control）组、50、100、200、300μmol/L干预组,培养12、24、48 h。镜下观察细胞形态及数量的变化;流式细胞技术法检测细胞周期的变化;细胞迁移实验观察细胞迁移的改变;明胶酶谱法检测细胞培养基中的MMP2、MMP9活性变化;RT-PCR检测MMP2、MMP9 mRNA表达水平的变化;Western Bloting检测MMP2、MMP9蛋白表达水平的变化。结果：黄芩素干预24 h后,与空白对照组相比较,各黄芩素干预组的细胞G1期均受阻滞,阻滞程度与黄芩素干预浓度成正向变化;黄芩素能有效抑制HeLa细胞的迁移,迁移距离与黄芩素干预浓度成反向变化;细胞培养基中MMP2及MMP9的活性受抑制,抑制程度与黄芩素干预浓度成正向变化;MMP2及MMP9 mRNA及蛋白表达随黄芩素干预浓度增加,呈逐渐降低的趋势（P〈0.05,P〈0.01）。结论：黄芩素可有效抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移,阻滞细胞周期中G1期、降低MMP2、MMP9活性,下调MMP2和MMP9的表达,发挥抑制宫颈癌HeLa细胞增殖的作用。     

Cyclin D1在结缔组织生长因子诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨Cyclin D1在结缔组织生长因子(CTGF)促进肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖中的作用.方法:分离并培养SD大鼠肺动脉中膜平滑肌细胞,实验使用第3～7代细胞.经鉴定的PASMCs给予浓度分别为5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml CTGF培养48 h.采用WST-1检测细胞增殖;实时荧光RT-PCR和Western blot方法检测Cyclin D1mRNA及蛋白的表达.结果:随着CTGF浓度的增加,各组PASMCs的OD值均逐渐升高,当浓度达到5 ng/ml时与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),呈浓度依赖性;随着CTGF浓度的增加,各组PASMCs的Cyclin D1 mRNA和蛋白均较对照组表达升高.结论:CTGF通过上调Cyclin D1表达促进PASMC增殖.     

靶向S1P2基因的siRNA有效片段慢病毒载体的筛选

目的:筛选能显著抑制原代培养的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞内1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1P2)基因表达的siRNA慢病毒载体。方法:SHR及SD大鼠各5只用于原代培养阴茎海绵体平滑肌细胞并分成6组,每组5个样本,每个样本约1.0×105个细胞,分别为携带靶向S1P2基因的siRNA-1~3号靶点的SHR慢病毒转染组(SHR siRNA-1、SHR siRNA-2和SHR siRNA-3组)、携带慢病毒空载体的SHR转染组(SHR GFP组)、SHR未转染对照组(SHR control组)和SD大鼠对照组(SD control组)。将靶向S1P2的siRNA片段的慢病毒载体,以感染复数(MOI)=60转染各组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,于转染72 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况,用Western blot分析各组S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在阴茎海绵体平滑肌细胞内的表达变化,RT-PCR检测各组阴茎海绵体平滑肌细胞S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA的表达。结果:荧光显微镜下观察SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP组细胞转染效率均80%;SHR GFP组与SHR control组相比,S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表达无明显差异,SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SD control组均显著低于SHR control组(P0.05)。而SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP组eNOS蛋白表达与SHR control组相比均无显著差别,但SD control组显著高于SHR control组(P0.05)。结论:3组针对S1P2的siRNA慢病毒载体均能显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内S1P2的表达,下调ROCK1和ROCK2表达,其中靶向S1P2的siRNA-1抑制效率最高。     

Mas基因沉默对血管紧张素-(1-7)拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响

 目的： 探讨Mas基因沉默后对血管紧张素-(1-7) ［Ang-(1-7)］拮抗血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响。方法：（1）有效Mas siRNA的筛选：设计合成3对不同序列针对Mas基因的siRNA,瞬时转染大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）,实验分5组：Mas siRNA序列1、Mas siRNA序列2、Mas siRNA序列3、阴性siRNA序列及正常对照组。转染后48 h,分别用半定量RT-PCR及Western blotting检测Mas mRNA和蛋白的表达水平。（2）研究有效Mas siRNA对Ang-(1-7)拮抗AngⅡ的影响：实验分6组：正常对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)组、阴性siRNA对照组和Mas siRNA转染组。分别培养72 h后,细胞免疫化学法检测细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,ELISA法检测上清液中细胞外基质成分Ⅰ型胶原（ColⅠ）的含量。结果：（1）与组相比,Mas siRNA各组Mas基因的表达均下降,其中以Mas siRNA序列2最明显（P<0.05）。 （2）有效Mas siRNA转染组在加AngⅡ+Ang-(1-7)干预72 h后,较非转染组和阴性siRNA转染组α-SMA及ColⅠ表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：Mas siRNA能有效抑制Mas的表达,使Ang-(1-7)拮抗AngⅡ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化作用明显减弱。     

血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响

目的: 观察血管紧张素-(1-7) 对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化及细胞外基质分泌的影响并初步探讨其机制。方法: 体外培养正常大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F), 分为对照组和Ang-(1-7)组、AngⅡ组和Ang-(1-7)+AngⅡ组, 培养72 h后, 细胞免疫化学染色法检测细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)表达; 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清液中TGF-β₁、IGF-I及细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)的含量。结果: 对照组仅有基础水平的α-SMA表达, 几无Col I、TGF-β₁和IGF-I表达, Ang-(1-7)组与之类似; AngⅡ组细胞α-SMA及ColⅠ、TGF-β₁、IGF-I表达较对照组显著增加(P<0.05); AngⅡ+Ang-(1-7)组与AngⅡ组比较, 细胞α-SMA及Col I、TGF-β₁、IGF-I表达明显减少(P<0.05)。结论: Ang-(1-7)可抑制AngⅡ诱导的肾间质成纤维细胞活化, 减少细胞外基质成分ColⅠ的合成, 其机制可能是通过下调致纤维化细胞因子TGF-β₁和IGF-I的表达。     

Akt1基因转染对BMSCs缺氧耐受影响的实验研究

目的探讨重组慢病毒(lentivirus,LVs)介导Akt1基因转染大鼠BMSCs能否提高细胞缺氧耐受能力,为提高干细胞移植治疗心肌梗死效果提供理论依据。方法以LVs作为转染载体,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标记,构建携带Akt1基因的p LVX-EGFP-3FLAG病毒载体。取第3代3~5周龄SD大鼠BMSCs分别转染p LVX-EGFP空白病毒液(B组)和p LVX-EGFP-3FLAG病毒液(C组),以未转染病毒的BMSCs为空白对照组(A组)。转染后2~3 d荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,并于48 h时采用Western blot法检测B、C组Akt1蛋白表达情况。将B、C组培养的BMSCs分别置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱进行缺氧干预(分别为B1、C1组),取B1、C1组缺氧干预0、3、6、9、12 h的细胞以膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶双染法行流式细胞仪分析细胞凋亡率和死亡率、MTT法分析细胞增殖情况、Western blot法检测凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达情况。结果转染后A组荧光显微镜下未见绿色荧光表达,B、C组可见明显绿色荧光,转染效率约60%;Western blot可检测到B、C组Akt1表达,且C组Akt1表达明显高于B组(t=17.525,P=0.013)。B1组缺氧干预后各时间点细胞凋亡率和死亡率均逐渐增高,差异有统计学意义(P0.05);C1组细胞凋亡率和死亡率在缺氧干预后3 h短暂下降,之后逐渐增高,差异有统计学意义(P0.05)。除0 h外,缺氧干预各时间点C1组细胞凋亡率和死亡率均显著低于B1组,差异有统计学意义(P0.05)。MTT法检测示,常氧条件下B、C组各时间点吸光度(A)值均显著高于缺氧条件下B1、C1组(P0.05),C组各时间点A值均显著高于B组(P0.05),缺氧干预后6、9、12 h B1组A值显著低于C1组(P0.05)。Western blot法检测示,与B1组比较,C1组缺氧干预各时间点Caspase-3表达均显著下调(P0.05)。结论通过重组LVs介导Akt1基因转染可通过抑制凋亡显著提高BMSCs的缺氧耐受能力,从而为改善干细胞移植治疗心肌梗死效果提供新思路。     

黄芩素对宫颈癌细胞凋亡的影响

目的：观察不同浓度的黄芩素干预宫颈癌HeLa细胞后细胞迁移及细胞周期的变化,观察细胞培养基中具有活性的金属基质蛋白酶－2（MMP －2）、金属基质蛋白酶9（MMP －9）的变化,及 MMP －2、MMP －9、金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP2）、细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）、B 细胞淋巴瘤／白血病－2（Bcl －2）相关 X 蛋白（Bax）、Bcl －2 mRNA 及蛋白水平表达的变化。方法体外黄芩素干预 Hela 细胞株24 h,分不含黄芩素的无血清DMEM 高糖培养基培养的细胞为空白对照组,无血清 DMEM 高糖细胞培养基中加入终浓度为100μmol／L 的黄芩素为100μmol／L 组,无血清 DMEM 高糖细胞培养基中加入终浓度为200μmol／L 的黄芩素为200μmol／L 组,共3组。镜下观察各组细胞形态及数量的变化、细胞迁移实验检测细胞迁移的改变、流式细胞技术法检测细胞周期发生的变化、RT －PCR 法及 Western blot 法检测 MMP －2、MMP －9、TIMP2、CyclinD1、Bax、Bcl －2 mRNA 及蛋白水平的表达变化。结果黄芩素干预24 h 后,与空白对照组比较,两干预组细胞周期 G1期受阻滞,阻滞程度与黄芩素干预浓度一致（P ＜0．05）,细胞迁移受抑制,随着黄芩素浓度逐渐增加,迁移距离逐渐减少（P ＜0．05）,MMP －2、MMP －9活性受到抑制,抑制程度与黄芩素浓度呈正相关（P ＜0．05）,MMP －2、MMP －9、CyclinD1、 Bcl －2的mRNA 及蛋白表达随黄芩素干预浓度增加,呈逐渐降低的趋势（P ＜0．05）,TIMP2、Bax 的 mRNA 及蛋白表达趋势随黄芩素浓度增加而逐渐增强（P ＜0．05）。结论黄芩素干预宫颈癌 HeLa 细胞,通过阻滞细胞周期 G1期,抑制 MMP －2、MMP －9活性,上调 TIMP2、Bax 的表达,下调 MMP －2、MMP －9、CyclinD1、Bcl －2的表达,促进 HeLa细胞的凋亡。     

黄芩素和U0126 体外协同抗人膀胱癌细胞的作用及机制研究

目的：探讨黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌T-24细胞的作用及机制研究。方法：用黄芩素、U0126及二者联合处理T-24细胞,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡;显微镜下计数细胞数量变化;TUNEL法检测细胞凋亡指数;实时定量PCR和Western blot分别检测T-24 细胞胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 、CyclinD1、GSK-3β和AKT ＲNA水平、蛋白水平,分析黄芩素与U0126对膀胱癌细胞凋亡和增殖的影响。结果：T-24细胞经不同浓度黄芩素处理后, 细胞凋亡率显著增加;T-24细胞经黄芩素处理24 h,G0/G1 期细胞比例明显增多,S 期细胞比例明显下降,细胞数减少,采用黄芩素联合U0126 处理T-24细胞24 h,S 期细胞比例显著降低;黄芩素或U0126单独处理T-24细胞引起明显细胞凋亡,二者联合处理凋亡更明显;利用两种药物单独或联合作用T-24细胞24 h,GSK-3β、ERK1/2、AKT磷酸化水平显著降低, ERK1/2、CyclinD1的 mRNA表达减少,联合处理作用更显著。结论：黄芩素和U0126 均可诱导T-24细胞凋亡,增加G0/G1 期细胞比例,降低S 期细胞比例,联合应用效果更明显。