高效液相色谱法测定人血浆3-氯酪氨酸浓度

目的建立人血浆3-氯酪氨酸（3-CT）浓度的定量分析方法。方法用三氯乙酸沉淀血浆蛋白后,HPLC—ECD定量检测。结果3．氯酪氨酸血浆标准曲线的线性范围为0．0625—2．000μmol·L^-1,r〉0．9966,回收率〉71．8％。日内和日间的精密度（RSD％）分别〈8．8％和11．1％。3-氯酪氨酸的保留时间为（16．57±0．30）min,总分析时间32min。测得健康人和尿毒症患者（各6例）血浆3-CT浓度分别为（0．16±0．13）和（2．47±0．73）μmol·L^-1（P〈0．01）。结论本法所需样本量低,预处理步骤简便,适用于临床进行氧化应激、治疗、预后、诊断等研究工作之需。     

50例PTFE人造血管术后存活率及并发症分析

一直以来,桡动脉-头臂静脉（bresica-cimino）自体动静脉内瘘因其寿命长、并发症低而成为维持性血透患者的首选血管通路,但即使经过仔细地术前筛选,仍有20％～40％患者不能成功建立自体动静脉内瘘[1],此时,polytetra-fluorothylene（PTFE）人造血管往往成为替代的选择。我们对近年PTFE人造血管通路的通畅率、并发症及相关因素进行回顾性分析。一、对象与方法1.研究对象:1997年10月至2000年10月,我们共对41例维持性血透患者进行了50例次PTFE人造血管置管术。患者平均年龄为（63±10）（28～81）岁,其中男性16例,女性25例,18例为糖尿病患者。所有患者接受人造血管手术之前均有自体动静脉内瘘失败史,其中22例曾有2次或以上失败记录。     

蛋白质的氧化修饰与尿毒症

氧化应激与慢性肾功能不全(CRF)的一系列并发症如高血压、动脉粥样硬化、贫血、炎症、衰老等的发生有着密切关系。近年来的研究已明确氨基酸、肽类及蛋白质极易遭受各种自由基及相关氧化剂的攻击。血浆蛋白遭受自由基攻击后,发生氧化修饰而生成-高级氧化蛋白产物(AOPPs,AdvancedOxidativeProteinProducts),因其可作为一个敏感的评定氧化应激的指标而日益引起人们的关注。一系列的研究都显示,AOPPs在慢性肾功能衰竭时明显升高,其不仅是反应氧化应激的新指标,同时也是一种新型的尿毒症毒素。     

次氯酸对人血清白蛋白的氧化修饰影响及与高级氧化蛋白产物的关系

目的 研究次氯酸对人血清白蛋白(HSA)的氧化修饰影响及与高级氧化蛋白产物(AOPPs)之间的关系。 方法 有氧条件下在恒定浓度的HSA(60 mg/ml)内加入不同浓度次氯酸(0、1、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L，最终浓度)，观察氧化剂对HSA的修饰作用。凝胶排阻色谱法检验HSA氧化修饰结果，在线光谱扫描(190 nm~400 nm)分析修饰产物的光谱特性。结果 次氯酸可氧化修饰人血清白蛋白，其修饰产物主要为二聚体HSA和六聚体HSA。发现次氯酸对HSA单体和HSA二聚体的氧化修饰为一级反应；对诱导生成的AOPPs为准一级反应；而对诱导生成的HSA六聚体则为二级修饰反应。同时发现白蛋白对AOPPs的主要贡献者是六聚体形式的HSA，光谱分析表明HSA聚集体的最大吸收峰发生红移，提示HSA聚集体是由于蛋白中的酪氨酸残基通过氧化交联方式而聚集形成的。 结论 HSA经次氯酸处理后主要发生了蛋白聚集。而对AOPPs的主要贡献者是六聚体形式的HSA。     

新型氧化应激标志物AOPPs的体外制备标准化和检测

目的 研究次氯酸氧化的人血清白蛋白(human serum albumin-advanced oxidative protem products,HSA-AOPPs)的制备标准化、次氯酸的清除以及微量HSA-AOPPs的检测.方法 于搅拌条件下在HSA(60mg/mL)内滴加次氯酸至终浓度为60 mmol/L即制得HSA-AOPPs.透析法或层析法清除次氯酸.碘量法测定次氯酸残留量.微量HSA-AOPPs的测定采用高效凝胶色谱法(HP-SEC),曲线下面积(AUC)用于定量计算.结果 恒定的次氯酸加入量对HSA-AOPPs的产量非常关键.当次氯酸和HSA两者克分子浓度之比为1:66左右时最为理想.过量次氯酸可导致高分子量AOPPs的破坏,大量蛋白碎片产生.层析法清除次氯酸残留优于透析法.色谱法检测AOPPs的灵敏度比分光光度法要高100倍以上.结论 AOPPs的标准化制备关键在于恒定次氯酸对HSA的克分子比值.HP-SEC方法可用于微量AOPPs的测定.     

三种尿毒素诱导高级氧化蛋白产物的生成

目的 探讨尿毒症患者体内长期积蓄的高水平尿毒素是否会通过参与高级氧化蛋白产物（AOPP）的生成而介导蛋白质的氧化损伤。 方法 以丙二醛(10 mmol/L)、马尿酸(20 mmol/L)和对甲酚(10 mmol/L)为尿毒素代表。人血清白蛋白(HSA)、健康人和尿毒症患者血浆用20 mmol/L的PBS(pH 7.4)统一调整到质量浓度为50 g/L，随后分别加入尿毒素至指定浓度。对照组内不加任何尿毒素。37℃分别温育0.5 h和24 h后，分别测定各组的AOPPs、蛋白巯基及二酪氨酸浓度。高效液相色谱（HPLC）法用于观察蛋白质的交联聚集情况。 结果 与对照组相比，尿毒素组的AOPP浓度平均增加了121.5％(P < 0.05)。尿毒素尚可降低蛋白巯基浓度，降低幅度平均达14.7％(P < 0.05)；同时蛋白二酪氨酸水平增至119.2％(P < 0.05)。HPLC结果表明尿毒素可以时间依赖性方式显著诱导高分子量AOPP(HMW-AOPPs)的生成，平均增幅为148.4％～333.3％(P < 0.05)。 结论 小分子类尿毒素可通过时间依赖性方式诱导HMW-AOPPs的生成而介导蛋白质的氧化损伤。除了髓过氧化物酶(MPO)-H2O2-Cl-通路的激活之外，尿毒素的介导损伤也是较为重要的体内AOPP生成机制之一。     

血浆白蛋白中胱氨酸和精氨酸是主要的氧化剂攻击基团

目的 探讨自由基攻击对白蛋白结构的影响。 方法 以正常人为对照组，尿毒症患者为实验组，高级氧化蛋白产物(AOPPs)和羰基为氧化应激指标。先对各组的氧化应激水平进行评价，随后从各组分离、纯化出白蛋白，再对其氨基酸组成进行分析比较。结果 尿毒症患者的AOPPs，及羰基水平约为正常人的2倍(P < 0.01)。同正常人相比，尿毒症患者水解出的17种白蛋白氨基酸组成大部分低10%左右，其中胱氨酸和精氨酸在两组间差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 氨基酸的普遍损失是影响血浆蛋白结构和功能的关键因素，其中胱氨酸和精氨酸是自由基攻击的两个主要靶基团。     

50例次PTFE人造血管术后存活率及并发症分析

目的　评估PTFE(polytetrafluorothylene)人造血管作为一种次选的血管通路 ,其通畅率、并发症及其相关影响因素。方法　对 41例慢性透析患者所进行的 50例次PTFE置管术进行回顾性分析。结果　 41例患者中糖尿病患者 1 8例 ,非糖尿病患者 2 3例 ,均有此前 1次或以上自体动静脉内瘘失败史。在 50例次PTFE手术中 ,上肢为 36例次 ,下肢 1 3例次 ,锁骨下 1例次。 50例次PTFE人造血管 0 .5、1、2年的累积生存率分别为65 .66 % ,61 .2 1 %及 43 .72 %。糖尿病与非糖尿病患者 ,上肢前臂与下肢人造血管的累积生存率无显著差异(P >0 .0 5)。人造血管术后并发症以血栓形成最为常见 (31例次 ) ,其他尚包括假性动脉瘤、感染、人造血管外露、血清瘤、出血 ,充血性肿胀等。结论　PTFE人造血管对无法建立自体动静脉内瘘的慢性透析患者有一定的辅助作用 ,但也存在着生存率低及并发症多的缺点     

高渗状态下肾脏COX2表达的基因调控

目的本研究旨在阐明核转录因子C／EBPβ和NFκB是否协同作用影响高渗状态下COX2的基因表达。方法体外培养肾髓间质细胞（RMICs），通过病毒转导或质粒转染技术将体外构建的COX2基因突变载体转入培养细胞，经高渗培养不同时间后．采用免疫印迹、荧光素酶报告基因活性检测等方法观察培养细胞COX2蛋白表达及活性的改变，同时应用染色质免疫沉淀分析法观察COX2基因与C／EBPβ、NFκB结合能力的改变。结果免疫印迹显示．高渗刺激能明显提高对照组COX2蛋白表达，应用突变序列IκBm阻断NFκB活性后COX2表达明显下降，应用突变序列C／EBPβ-P20阻断C／EBPβ亦能显著降低COX2表达．但同时运用突变序列C／EBPβ-P20和IκBm无法使COX2表达进一步下降。然而，将野生型、含NFκB或C／EBPβ结合位点突变的COX2启动子萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒转染至RMICs，高渗培养24h后显示：高渗刺激能显著增加野生型组COX2荧光素酶的活性，NFκB位点突变无法阻断该作用，而C／EBPβ结合位点突变却能完全抑制COX2高活性。进一步应用染色质免疫沉淀分析研究显示．高渗刺激能显著增加NhB（P65）或C／EBPβ与COX2基因的结合，并呈时间依赖性；NFκB结合位点突变不能消除高渗诱导的NFκB（P65）与COX2基因的结合增强，但在NFκB和C／EBPβ结合位点同时突变组该作用被阻断。结论在NFκB活化COX2基因转录过程中需要另一个核转录因子C／EBPβ的参与，C／EBPβ途径在高渗诱导肾脏内髓间质细胞表达COX2过程中具有重要作用。