聚合酶链式反应变性温度与产物假阴性的研究

背景:虽然聚合酶链反应方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点,但同时也发现用聚合酶链反应技术进行生物化学实验和医学检验时,经常会出现假阴性的现象.目的:探讨聚合酶链反应变性温度与产物假阴性关系.设计、时间及地点:观察实验,于2008-03在占林大学第二医院中心实验室完成.材料:重组质粒pUC-19(含有HBV完整基因组)和人肠杆菌JM109由吉林人学第二医院中心实验室提供.质粒DNA小量抽提试剂盒购自爱思进AXYGEN生物技术(杭州)公司.方法:以含有HBV完整基因组的蕈组质粒pUC-19为模板进行聚合酶链反应扩增,人为改变聚合酶链反应循环变性温度,观察其对聚合酶链反应扩增结果的影响.主要观察指标:以不加模板的反应体系为阴性对照,以加2倍于正常反应体系的模板反应体系为阳性对照,肉眼在紫外灯下观察小到产物判为阴性.结果:随着变件温度的降低,聚合酶链反应扩增效率降低,产物量明显减少.当变性温度低至85℃及85℃以下,琼脂糖凝胶电泳肉眼观察小到扩增产物.结论:较低的变性温度可导致扩增效率降低甚至假阴性的结果.     

聚合酶链式反应变性温度与产物假阴性的研究

背景：虽然聚合酶链反应方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点,但同时也发现用聚合酶链反应技术进行生物化学实验和医学检验时,经常会出现假阴性的现象。 目的：探讨聚合酶链反应变性温度与产物假阴性关系。 设计、时间及地点：观察实验,于2008-03在吉林大学第二医院中心实验室完成。 材料：重组质粒pUC-19(含有HBV 完整基因组)和大肠杆菌JM109由吉林大学第二医院中心实验室提供。质粒DNA 小量抽提试剂盒购自爱思进AXYGEN 生物技术(杭州)公司。 方法：以含有HBV 完整基因组的重组质粒pUC-19为模板进行聚合酶链反应扩增,人为改变聚合酶链反应循环变性温度,观察其对聚合酶链反应扩增结果的影响。 主要观察指标：以不加模板的反应体系为阴性对照,以加2倍于正常反应体系的模板反应体系为阳性对照,肉眼在紫外灯下观察不到产物判为阴性。 结果：随着变性温度的降低,聚合酶链反应扩增效率降低,产物量明显减少。当变性温度低至85 ℃及85 ℃以下,琼脂糖凝胶电泳肉眼观察不到扩增产物。 结论：较低的变性温度可导致扩增效率降低甚至假阴性的结果。     

不同条件对腮腺炎减毒活疫苗生产影响的研究

目的:研究毒种感染剂量(MOI)及维持液中小牛血清浓度对腮腺炎减毒活疫苗生产的影响。方法:用不同的感染剂量制备腮腺炎减毒活疫苗,测定疫苗病毒滴度,观察毒种不同感染剂量对腮腺炎减毒活疫苗生产的影响。感染腮腺炎病毒时,加入含1%和2.5%小牛血清的细胞维持液,制备腮腺炎减毒活疫苗,测定病毒滴度,观察不同浓度小牛血清对腮腺炎减毒活疫苗生产的影响。结果:毒种的感染剂量为1!50、1!500、1!5000时,制备的腮腺炎减毒活疫苗的病毒滴度分别为5.76、6.13、5.79LogCCID50/ml。用含1%和2.5%小牛血清的细胞维持液,制备出高滴度腮腺炎减毒活疫苗分别为12.33%和30.99%。结论:毒种的感染剂量为1!500时,制备的腮腺炎减毒活疫苗的病毒滴度最高。提高细胞维持液中小牛血清的浓度,可以提高腮腺炎减毒活疫苗的病毒滴度。     

肾综合征出血热疫苗柱层析方法比较

我们用几种不同柱层析系统对出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗进行纯化 ,建立适合出血热病毒抗原的纯化方法。1.材料和方法 :(1)疫苗原液制备 :按现行原代地鼠肾细胞出血热疫苗生产工艺进行 ,毒株采用Ｌ99、ＰＳ6、ＪＲＣ 1。滤器为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司产品 ,选择适当分子量的滤膜 ,将疫苗原液超滤浓缩。(2 )柱层析提纯疫苗抗原试验 :①亲和层析 :取 2 0ｍｌｃｅｌｌｕｆｉｎｅｓｕｌｆａｔｅｇｅｌ(Ａｍｉｃｏｎ产品 )装柱 (ＸＫ16 / 30 ) ,Ａ 2 80ｎｍ监测 ,用下述条件分别进行实验 :用 ｐＨ7.2 0 .0 1ｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液 (ＰＢ)平衡 ,上…     

引物末端不同碱基对聚合酶链反应产物影响

目的 探索引物末端3'端不同碱基对聚合酶链反应产物的影响.方法 以含有乙肝病毒(HBV)完整基因组的重组质粒pUC-19为模板,利用3'端碱基分别为A,T,C,G的下游引物,在相同的上游引物和退火温度下进行聚合酶链反应.结果 不同的反应体系在相同退火温度下目的 产物和引物二聚体形成不同;A表示上游引物,P表示下游引物;下游引物共计4条,分别用P1、P2、P3、P4表示,其3'端碱基分别为T,G,A,C.上下游引物共4对,分别用AP1、AP2、AP3、AP4表示;退火温度为50℃时,AP1和AP4有明显的扩增产物,AP3扩增产物稍少,AP2产物肉眼观察不到,有非特异性产物生成;退火温度升至55℃时,AP1和AP2有明显的扩增产物,AP4少量扩增产物,P3产物肉眼观察不到,AP1和AP4反应体系引物二聚体生成情况基本相同,AP2和AP3引物二聚体生成较少;退火温度升至62℃时,AP1和AP2有明显的扩增产物,AP4扩增产物稍少,AP3产物肉眼观察不到,可观察到引物二聚体生成稍多.结论 3'端不同碱基对聚合酶链反应产物有很大影响.