续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的疗效及转录机制研究

探讨续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的临床疗效及转录组机制。方法 选取肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症患者,随机分为续苓健骨颗粒试验组及骨化三醇对照组。观察两组中医证候积分、骨密度及安全性指标。取6例试验组患者治疗前、后的外周血进行转录组测序,另选6例健康组作为对照,筛选差异表达基因并行KEGG分析。结果 完成病例：试验组27例,对照组27例。试验组中医证候疗效总有效率为96.30 %,显著优于对照组的77.78 %（P?0.05）。治疗后两组中医证候积分、腰脊刺痛、下肢痿软等临床症状评分较治疗前均下降（P<0.05）,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。两组治疗前后骨密度比较差异无统计学意义（P>0.05）,但均保持稳定或呈现上升趋势。两组均未出现严重不良反应。转录组测序：试验组治疗前、后有319个差异基因;试验组治疗前与健康组有598个差异基因,其中19个差异基因（包括FOSB、H4C2、RAMP3等）在治疗后其表达显著改变。KEGG分析结果表明,FOSB参与破骨细胞分化、IL-17信号通路。结论 续苓健骨颗粒治疗绝经后骨质疏松症,能够显著改善临床症状,中医证候疗效优于骨化三醇,其作用机制可能与FOSB、RAMP3、H4C2基因及FOSB参与的破骨细胞分化、IL-17信号通路相关。     

成骨细胞与破骨细胞共培养及其应用研究进展

成骨细胞与破骨细胞并非孤立存在,两种细胞存在直接接触、分泌旁分泌因子、细胞与骨基质3种相互作用.成骨细胞与破骨细胞共培养技术有直接接触式、间接接触式2类方式,它能最大程度地模拟体内微环境,有利于研究两细胞间的相互作用,探讨两者失衡在骨质疏松症等骨代谢疾病形成中的作用;细胞共培养应根据病理状态下两细胞的比例选用种属来源一致的细胞.目前该技术主要用于探讨药物防治骨质疏松症的作用机制,已有淫羊藿、三七、补骨脂、雷奈酸锶等既促进成骨细胞骨形成,又抑制破骨细胞骨吸收活性的双重药理作用研究等报道.成骨细胞与破骨细胞共培养的一个新的应用方向,将是应用于软骨下骨重建功能活动的探讨以及中西药干预骨性关节炎的研究.     

miRNA在绝经后骨质疏松症肾阴虚证中的表达谱特征及生物信息学分析

目的探讨绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)肾阴虚证miRNA的表达谱特征,及对差异表达的miRNA进行生物信息学分析。方法随机选择绝经后骨质疏松症受试者,中医辨证,分为3组:PMOP肾阴虚组3例,PMOP肾阳虚组3例,健康绝经后妇女3例作为对照组。采用人miRNA芯片检测外周血单个核细胞miRNA的表达水平。肾阴虚证组分别与其他两组比较,筛选共同的差异表达基因,实时荧光定量PCR验证芯片结果,并对差异表达的miRNA进行pathway分析及靶基因预测。结果肾阴虚证组与对照组、肾阳虚证组两组比较,筛选出20条共同差异表达miRNA;实时定量PCR验证hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p表达的结果与芯片结果相符;pathway分析结果显示,这些差异miRNA主要参与代谢通路、癌症通路、Rap1信号通路、粘着斑信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工、c GMP-PKG信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路的调控;结合多个数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测,最终筛选出9个靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)。结论建立了PMOP肾阴虚证的miRNA基因表达谱,且这20个差异表达的miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、Wnt等与骨代谢相关信号通路参与PMOP肾阴虚证的发生发展过程。     

Raji-MG63细胞共培养体系中心肌营养蛋白样细胞因子1(CLCF1)对RANKL/OPG比值及成骨细胞分化的影响

目的探讨Raji-MG63细胞共培养体系中,心肌营养蛋白样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因对骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和成骨细胞分化的影响。方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CLCF1基因敲除Raji细胞系,实验分2组:对照组(Control组)和CLCF1敲除组(CLCF1-KO组)。应用Transwell技术建立Raji-MG63细胞共培养体系,通过蛋白质印迹法(western blot,WB)检测CLCF1、OPG、RANKL及JAK2/STAT3蛋白的变化。运用碱性磷酸酶(ALP)活性检测和茜素红染色观察成骨细胞分化能力。结果WB结果显示,与对照组比较,CLCF1敲除组OPG(P<0.01)蛋白明显下调,RANKL/OPG比值升高(P<0.001),磷酸化JAK2(P<0.001)和STAT3(P<0.01)蛋白明显下调,差异具有统计学意义;ALP活性检测和茜素红染色结果显示,Raji-MG63细胞共培养体系中,CLCF1敲除组MG63细胞ALP活性和矿化形成能力降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。结论CLCF1基因能通过调控RANKL/OPG比值和JAK2/STAT3通路影响成骨细胞分化。     

骨碎补-续断药对对成骨/破骨代谢的双向调控作用及其对Hif1ɑ基因的影响

目的 分析骨碎补-续断药对对成骨/破骨代谢的调控作用并初步探讨其机制。方法 分别制备空白、低剂量、中剂量及高剂量的骨碎补-续断含药血清。采用CCK-8法、ALP染色法和茜素红染色法,分别观察含药血清对MC3T3-E1细胞增殖、成骨和矿化能力的影响;采用CCK-8法和TRAP染色法观察含药血清对RAW264.7细胞增殖和破骨分化能力的影响。采用系统药理学的方法分析药物的可能作用靶点,并结合RT-PCR和Western-blot的方法验证。结果 中剂量和高剂量骨碎补-续断含药血清可促进MC3T3-E1细胞的增殖,抑制RAW264.7细胞的增殖,中剂量组和高剂量组间没有明显差异;同时,中、高剂量含药血清可促进MC3T3-E1细胞的ALP活性和钙化能力,抑制RAW264.7细胞的TRAP活性,中剂量和高剂量间没有显著性差异。骨碎补-续断药对的可能作用靶点涉及HIF1ɑ,RT-PCR和Western-blot结果证实中剂量含药血清可提高MC3T3-1细胞Hif1ɑ基因的mRNA和蛋白水平及RAW264.7细胞的HIF1ɑ蛋白水平。结论 骨碎补-续断药对具有促进成骨代谢,抑制破骨代谢的作用,HIF...     

续苓健骨方联合阿仑膦酸钠调控EphB4/EphrinB2双向通路对去卵巢骨质疏松大鼠的研究

目的 观察续苓健骨方联合阿仑膦酸钠对去卵巢快速骨丢失模型大鼠骨密度、结构、骨代谢和EphB4/EphrinB2信号通路的影响,探讨其作用机制。方法 50只雌性SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、续苓健骨方组、阿仑膦酸钠组和联合用药组,行双侧卵巢切除术制备模型;药物分别干预12周后取材,DXA检测股骨骨密度,HE染色观察胫骨组织显微结构,ELISA检测血清Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)水平,Real-time PCR和Western blot检测腰椎EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白的表达水平。结果 与假手术组相比,模型组骨密度显著降低(P＜0.001),骨小梁稀疏并且排列紊乱,S-CTX和PINP含量均增高(P＜0.01),骨组织EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P＜0.001)。与模型组相比,3个药物组骨密度均增高,其中以联合用药组最佳(P＜0.001),骨小梁较密并且排列规则,S-CTX含量不同程度降低,PINP含量不同程度增高,EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均增高。结论 续苓健骨方联合阿仑膦酸钠起协同作用,可能通过激活EphB4/EphrinB2信号通路改善骨组织显微结构和血清骨代谢指标,从而提高大鼠骨密度起抗骨质疏松作用。     

基于ERK/mTOR信号通路探讨六味地黄丸对氧化应激状态下成骨细胞自噬的影响

目的 从ERK/mTOR信号通路观察六味地黄丸对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞自噬的影响,探讨其治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。方法 用过氧化氢（H2O2）模拟氧化应激状态,六味地黄丸（LWDH）含药血清干预MC3T3-E1细胞,将细胞分为Model组（H2O2干预）、Blank组（空白血清）、LWDH组（LWDH含药血清）、Rap组（mTOR通路抑制剂）、U0126组（ERK通路抑制剂）、Rap+LWDH组（mTOR通路抑制剂、LWDH含药血清）、U0126+LWDH组（ERK通路抑制剂、LWDH含药血清）;以不做干预的Control组作为对照。通过细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测细胞ROS水平;检测自噬蛋白LC3B及ERK/mTOR信号通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果 ROS结果显示,与Model组相比,LWDH组、Rap组、U0126等各组细胞的ROS水平皆降低（P＜0.05）。Western blot结果显示,与Model组相比,LWDH组、Rap组、LWDH+Rap组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ增高（P＜0.05）;与Model组相比,LWDH组、Rap组与Rap+LWDH组的p-mTOR蛋白表达下调（P＜0.05）,LWDH组、U0126组的p-ERK1/2蛋白表达下调（P＜0.05）。结论 六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制可能与抑制ERK/mTOR信号通路诱导氧化应激状态下成骨细胞自噬相关。     

绝经后骨质疏松症肾阴虚证的免疫蛋白相关研究

目的探讨绝经后骨质疏松症肾阴虚证与LRG1、SRC蛋白表达变化的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阴虚证组25例,30例健康绝经后妇女为对照组,Western-blot法检测外周血LRG1、SRC的蛋白表达。结果肾阴虚证组LRG1蛋白表达水平(1.2391±1.5860)高于对照组(0.8033±0.7485),有升高趋势,差异无统计学意义(Z=-0.085,P=0.933),肾阴虚证组SRC蛋白表达水平(0.7873±0.6275)与对照组(0.3712±0.4064)比较,差异有统计学意义(Z=-2.874,P=0.004)。结论骨质疏松症肾阴虚证与SRC蛋白表达升高相关联。     

hsa-miR-655靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的实验研究

目的研究靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNAs。方法通过生物信息学预测可能与CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)作用的miRNAs;将人工合成的野生型和突变型CLCF1基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒;将重组荧光素酶报告载体和miRNAs表达载体共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证miRNA对CLCF1基因翻译水平的抑制作用。结果生物信息学预测结果显示,CLCF1基因3'UTR与hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515等5个miRNAs存在互补结合位点;双荧光素酶实验结果表明,与对照组比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09%,差异有显著性意义(P=0.001),当使用突变型CLCF1基因3'UTR,荧光活性上调至67.22%,说明hsa-miR-655对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用;与对照组比较,hsa-miR-374c和hsa-miR-515组荧光活性分别下调27.27%(P=0.000)和27.74%(P=0.006),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有一定抑制作用;hsa-miR-300和hsa-miR-381组与对照组相比,荧光活性分别下调6.35%(P=0.213)和9.89%(P=0.127),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达无明显抑制作用。结论 hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的表达。     

续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血液钙磷代谢的影响

目的研究续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度、骨微结构和血液钙磷代谢的影响。方法将40只6月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、续苓健骨方组[12.71 g/(kg·d)]和碳酸钙组[104.19 mg/(kg·d)],假手术组仅切除卵巢周围脂肪,其余组行双侧卵巢切除术后建立骨质疏松模型。药物干预12周后取材,通过双能X线骨密度仪检测左侧胫骨骨密度,经Masson染色观察右侧胫骨组织显微结构,生化检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、血钙和血磷水平。结果与假手术组相比,模型组骨密度显著降低,骨小梁断裂稀疏、排列不规则,TRAP表达增加,血钙含量降低,血磷含量升高。与模型组相比,续苓健骨方组骨密度增加,骨小梁数量增加、排列较规则,TRAP表达降低,血钙含量升高,血磷含量降低。结论续苓健骨方可提高去卵巢骨质疏松大鼠胫骨骨密度并改善骨组织微结构,其机制可能与调控血钙磷代谢稳态有关。