水溶性脂聚体介导NR2B siRNA治疗神经病理性痛的实验研究

目的 探讨水溶性脂聚体(WSLP)介导含2B亚基的N-甲基-D-天冬氨酸受体小干扰RNA(NR2B siRNA)治疗大鼠神经病理性痛的可行性.方法 健康雄性SD大鼠100只,周龄6周,体重180～200 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为5组(n=20):对照组(C组)、假手术组(S组)、神经病理性痛组(NP组)、WSLP-NR2B siRNA组(W组)、WSLP-阴性对照NR2B siRNA(WN组).采用坐骨神经分支部分结扎法制备大鼠神经病理性痛模型.C组不予任何处理;S组仅暴露坐骨神经,不牵拉和损伤神经;NP组于制备模型后即刻鞘内注射生理盐水20μl;W组和WN组于制备模型后即刻分别鞘内注射相应的siRNA 20μl.于模型制备前1 d及制备后3、7、14和21 d时测定机械缩足反应阈值(MWT)及热缩足反应持续时间(TWD),模型制备后3 d,痛阈测定结束后,每组取10只大鼠,取L4-6节段背根神经节,测定NR2B mRNA及其蛋白的表达水平.结果 与S组比较,NP组、W组和WN组MWT降低,TWD延长,NR2B mRNA及其蛋白表达上调(P＜0.05或0.01),C组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与NP组比较,W组MWT升高,TWD缩短,NR2B mRNA及其蛋白表达下调(P＜0.01),WN组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 WSLP不仅成功介导NR2B siRNA,抑制NR2B的表达,还可减轻大鼠神经病理性痛.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of NR2B small interference RNA(NR2B siRNA)carried by water-soluble lipopolymer(WSLP)for treatment of neuropathic pain in rats.Methods One hundred healthy male SD rats weighing 180-200 g were randomly divided into 5 groups(n=20 each):normal control group (group C),sham operation group(group S),neuropathic pain group(group NP),group WSLP-NR2B siRNA (group W)and group WSLP-negative NR2B siRNA(group WN).Neuropathic pain was induced by partial ligation of sciatic nenre.WSLP-NR2B siRNA complex was formed by binding WSLP and NR2B siRNA.Normal saline.WSLP-NR2B siRNA complex and WSLP-negative NR2B siRNA 20μl were injected intrathecally after operation in NP,W and WN groups respectively.Mechanical withdrawal threshold(MWT)and thermal withdrawal duration (TWD)were measured before(baseline)and at 3,7,14 and 21 days after operation.Ten animals in each group were sacrificed on the 3rd day after operation and the lumbar segment(L4-6)of the dorsal root ganglia was removed for determination of the expression of NR2B mRNA and protein using RT-PCR and Western blot analysis.Results Sciatic nerve ligation significantly decreased MWT and prolonged TWD and increased NR2B mRNA and protein expression in group NP as compared with group C.WSLP-NR2B siRNA complex significantly reduced sciatic nerve ligation-induced hyperalgesia and decreased NR2B mRNA and protein expression in group W as compared with group NP.Conclusion WSLP not only mediates NR2B siRNA successfully and inhibits the expression of NR2B,but also reduces neuropathic pain in rats.     

鞘内注射水溶性脂聚体运载NR2B siRNA减轻坐骨神经缩窄性损伤大鼠神经病理性疼痛

脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（NR2B）的过度表达在神经病理性疼痛的产生和维持方面起关键作用,利用siRNA抑制NR2B的表达有望成为神经病理性疼痛甚至神经损伤治疗的新途径,然而,目前仍然缺乏NR2B siRNA安全且高效的载体。本实验探讨了低分子量聚乙烯亚胺和胆固醇组成的水溶性脂聚体（WSLP）运载NR2B siRNA治疗大鼠神经病理性疼痛的可行性,以寻找神经病理性疼痛基因治疗的安全且高效的载体。结果发现：WSLP与NR2B siRNA复合物（WSLP/siRNA）鞘内注射后3d,坐骨神经缩窄性损伤导致的神经病理性疼痛大鼠脊髓背角NR2B的基因表达显著下降,转录水平及蛋白水平的表达分别下降59%及54%（P < 0.01）,WSLP/乱序siRNA(scRNA) 及低分子量聚乙烯亚胺/siRNA鞘内注射后NR2B的基因表达无明显变化。WSLP/siRNA鞘内注射后3,7,14及21d神经病理性痛大鼠患足的疼痛程度明显减轻,而注射低分子量聚乙烯亚胺/ siRNA及WSLP/scRNA却无此作用。由此表明,WSLP可有效运载siRNA抑制神经病理痛大鼠NR2B基因的过度表达,从而对神经病理性疼痛大鼠具有治疗作用。     

人脐静脉内皮细胞表达CD137分子及其功能的初步研究

目的　了解人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)CD137分子的表达情况 ,探讨其对内皮细胞功能的影响。方法　胰蛋白酶法分离培养人脐静脉内皮细胞 ,用RT PCR、定量荧光PCR和流式细胞仪技术 ,分别观测未刺激和用内毒素 (LPS)刺激的内皮细胞CD137mRNA与蛋白的表达情况。用anti CD137单克隆抗体交联内皮细胞表面CD137,ELISA检测其上清液中IL 8的含量。结果　①RT PCR和实时荧光定量RT PCR结果显示 ,未经刺激的人脐静脉内皮细胞表达少量CD137mRNA ,流式细胞仪检测证实其细胞表面表达少量CD137蛋白 ;当用LPS刺激内皮细胞培养 2 4h后 ,mRNA和蛋白表达量均显著提高。②ELISA检测发现 ,anti CD137单克隆抗体交联内皮细胞表面CD137分子后 ,和同型抗体对照组相比 ,其培养上清液中细胞因子IL 8的表达量明显提高 ,与LPS刺激内皮细胞上调IL 8表达的程度相当。结论　人脐静脉内皮细胞组成性表达少量CD137分子 ,LPS可以显著上调其表达。交联内皮细胞表面CD137分子可提高其IL 8产生和分泌 ,提示其具有刺激内皮细胞活化的生物功能     

NMDA受体过度激活对严重烧伤大鼠血清炎性细胞因子水平的影响

目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的过度激活对大鼠严重创伤血清炎性细胞因子水平的影响,为探索从中枢的某一环节着手,来抑制严重创伤后的炎性反应失调提供理论依据。方法:以30%TBSAⅢ度烧伤为严重创伤模型,利用ELISA方法检测激活NMDA受体对血清炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1#(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平的影响;通过膜片钳技术检测严重烧伤能否导致大鼠神经元NMDA受体的过度开放;再观察阻断NMDA受体能否抑制严重烧伤后血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的上升。结果:(1)与对照组相比,使用NMDA0.5mg/kg激活NMDA受体,血清TNF-α、IL-1β、IL-6明显升高,加大剂量(2mg/kg)可以使血清TNF-α、IL-1β、IL-6进一步升高;(2)在35pS电导水平的开放中,烧伤使通道开放概率增加非常显著,在100pS电导水平的开放中,开放时间常数τ、通道开放概率增加非常显著;(3)腹腔注射MK-1801(3mg/kg)阻断NMDA受体可以抑制烧伤后血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的上升,加大注射剂量(5mg/kg)可以进一步抑制烧伤后血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的上升。结论:NMDA受体是严重创伤(烧伤)后大鼠血清炎性细胞因子过度升高的重要环节。     

水溶性脂质体运载siRNA沉默大鼠脊髓NR1表达可行性的实验研究

目的探讨水溶性脂质体(WSLP)运载N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NR1)小干扰RNA(siRNA)沉默大鼠脊髓NR1表达的可行性。方法根据文献合成WSLP,将合成的WSLP与siRNA连接形成WSLP/siRNA。将18只SD大鼠随机均分为3组:NS组(鞘内注射生理盐水)、WSLP/siRNA组(鞘内注射WSLP/siRNA混合物)、裸siRNA组(鞘内注射裸siRNA)。通过实时定量PCR和Western blot技术分别检测各组大鼠脊髓NR1 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 NS组与裸siRNA组脊髓NR1 mRNA和蛋白表达水平无明显差异,WSLP/siRNA组脊髓NR1mRNA和蛋白表达水平下降。结论 WSLP可有效运载siRNA沉默大鼠脊髓NR1 mRNA和蛋白表达,为WSLP运载NR1-siRNA治疗慢性疼痛的实验打下基础。     

水溶性脂聚体可运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B小干涉RNA治疗慢性炎性疼痛

目的 慢性炎性疼痛的基因治疗缺乏安全且高效的载体,本实验探讨了低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和胆固醇组成的水溶性脂聚体(water-soluble lipopolymer,WSLP)运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-Methyl-D-aspartic acid receptor 2B,NR2B)小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)治疗大鼠慢性炎性疼痛的可行性. 方法 将WSLP直接与靶向NR2B的siRNA连接形成WSLP/siRNA复合物,乱序siRNA作为对照(WSLP/scRNA);然后检测鞘内注射WSLP/siRNA对完全弗氏佐剂(freund's adjuvant complete,CFA)炎性痛模型大鼠脊髓背角(spinal cord doral horn,SCDH)NR2B蛋白表达的影响,并且测定鞘内注射此复合物后炎性痛大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)及热缩足反射持续时间(thermal withdrawal duration,TWD)的变化. 结果 WSLP/siRNA注射后3d,炎性疼痛大鼠SCDH NR2B蛋白水平的表达与CFA组比较显著下降58％(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA注射后NR2B的表达无明显变化(P＞0.05).WSLP/siRNA鞘内注射后3、4d及5d炎性痛大鼠的MWT [(3 d:(9.2±1.3);4 d:(9.8±1.2);5 d:(9.5±1.2)]较CFA组[(3 d:(4.6±1.2);4 d:(4.9±1.8);5 d:(5.0±1.8)]显著增高(P＜0.01),TWD[(3 d:(3.27±0.32)s;4 d:(3.83±0.49)s;5 d:(3.57±0.33)s]较CFA组[(3 d:(6.71±0.45)s;4 d:(6.97±0.54)s;5 d:(6.63±0.38)s]显著缩短(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA均无此治疗作用(P＞0.05). 结论 WSLP可有效运载siRNA抑制CFA所致慢性炎性痛大鼠NR2B的过度表达,从而对炎性疼痛大鼠具有治疗作用.     

水溶性脂质体运载基因药物复合物治疗大鼠神经病理性痛

背景：有研究报道病毒载体运载N-甲基-D天冬氨酸受体1小干扰RNA可有效缓解大鼠炎性疼痛,但病毒载体存在安全隐患。 目的：探讨水溶性脂质体运载N-甲基-D天冬氨酸受体1小干扰RNA在体内外沉默N-甲基-D天冬氨酸受体1的效应和治疗神经病理性痛的可行性。 方法：将PC12随机分为阴性转染组、对照转染组和水溶性脂质体转染组,分别以N-甲基-D-天冬氨酸受体1 小干扰RNA、聚乙烯亚胺与N-甲基-D-天冬氨酸受体1 小干扰RNA的复合物及水溶性脂质体与N-甲基-D-天冬氨酸受体1 小干扰RNA的复合物转染PC12细胞,检测各组N-甲基-D-天冬氨酸受体1 基因mRNA及蛋白水平表达的变化。将48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、聚乙烯亚胺组及水溶性脂质体组,后3组建立大鼠神经病理性疼痛模型,并分别鞘内注射生理盐水、聚乙烯亚胺与N-甲基-D-天冬氨酸受体1 小干扰RNA的复合物和水溶性脂质体与N-甲基-D-天冬氨酸受体1 小干扰RNA的复合物;假手术组只暴露坐骨神经。 结果与结论：水溶性脂质体转染组N-甲基-D-天冬氨酸受体1的 mRNA与蛋白表达水平明显低于其他两组(P < 0.01)。与假手术组比较,模型组、聚乙烯亚胺组及水溶性脂质体组N-甲基-D-天冬氨酸受体1 的mRNA和蛋白表达上调,累积疼痛评分升高(P < 0.01);与模型组比较,水溶性脂质体转染组脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸受体1 mRNA与蛋白表达及累积疼痛评分下降(P < 0.01),聚乙烯亚胺组上述指标无明显变化(P > 0.05)。表明在体内条件下水溶性脂质体可有效运载N-甲基-D-天冬氨酸受体1 小干扰RNA,抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体1 的过度表达,还可减轻大鼠神经病理性痛。     

水溶性脂质体运载siRNA对神经病理性疼痛大鼠脊髓NMDA受体1的影响

目的探讨水溶性脂质体(WSLP)运载N-甲基-D-天冬氨酸受体1(N-methyl-D-aspartate receptor1,NMDAR1)利用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)治疗神经病理性疼痛的可行性。方法采用坐骨神经分支选择结扎切断(spared nerve injury model,SNI)制作神经病理性疼痛大鼠模型,选取鞘内置管成功SD大鼠24只,随机均分为四组:S组,仅暴露坐骨神经,不结扎;C组,SNI+鞘内注射生理盐水;W组,SNI+鞘内注射WSLP/siRNA混合物;L组,SNI+鞘内注射乱序siRNA与WSLP混合物。通过实时定量PCR和western-blot技术分别检测各组大鼠脊髓背角NMDAR1 mRNA相对表达和NMDAR1蛋白表达水平的变化。结果 C组和L组第4天脊髓背角NMDAR1 mRNA相对表达和NMDAR1蛋白表达水平显著高于S、W组(P<0.05)。结论 WS-LP可有效运载siRNA抑制神经病理性疼痛大鼠NMDAR1的过度表达。     

水溶性脂质体运载基因药物复合物治疗大鼠神经病理性痛

背景：有研究报道病毒载体运载 N-甲基-D 天冬氨酸受体1小干扰 RNA 可有效缓解大鼠炎性疼痛,但病毒载体存在安全隐患.目的：探讨水溶性脂质体运载 N-甲基-D 天冬氨酸受体1小干扰 RNA 在体内外沉默 N-甲基-D 天冬氨酸受体1的效应和治疗神经病理性痛的可行性.方法：将 PC12随机分为阴性转染组、对照转染组和水溶性脂质体转染组,分别以 N-甲基-D-天冬氨酸受体1小干扰 RNA、聚乙烯亚胺与 N-甲基-D-天冬氨酸受体1小干扰 RNA 的复合物及水溶性脂质体与 N-甲基-D-天冬氨酸受体1小干扰 RNA 的复合物转染 PC12细胞,检测各组 N-甲基-D-天冬氨酸受体1基因 mRNA 及蛋白水平表达的变化.将48只 SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、聚乙烯亚胺组及水溶性脂质体组,后3组建立大鼠神经病理性疼痛模型,并分别鞘内注射生理盐水、聚乙烯亚胺与N-甲基-D-天冬氨酸受体1小干扰 RNA 的复合物和水溶性脂质体与 N-甲基-D-天冬氨酸受体1小干扰 RNA 的复合物;假手术组只暴露坐骨神经.结果与结论：水溶性脂质体转染组 N-甲基-D-天冬氨酸受体1的 mRNA 与蛋白表达水平明显低于其他两组（P 〈0.01）.与假手术组比较,模型组、聚乙烯亚胺组及水溶性脂质体组 N-甲基-D-天冬氨酸受体1的 mRNA 和蛋白表达上调,累积疼痛评分升高（P 〈0.01）;与模型组比较,水溶性脂质体转染组脊髓背角 N-甲基-D-天冬氨酸受体1 mRNA 与蛋白表达及累积疼痛评分下降（P 〈0.01）,聚乙烯亚胺组上述指标无明显变化（P 〉0.05）.表明在体内条件下水溶性脂质体可有效运载 N-甲基-D-天冬氨酸受体1小干扰 RNA,抑制 N-甲基-D-天冬氨酸受体1的过度表达,还可减轻大鼠神经病理性痛.