实时荧光PCR检测17-AAG对人RPE细胞Akt等基因表达的调控

目的:建立检测17-AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17-AAG对人RPE细胞中Akt,Raf,Hsp90,Hsp70基因表达的调控。方法:体外培养人RPE细胞株。当加入处理因素17-AAG并作用不同浓度及时间梯度后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据Akt,Raf,Hsp90,Hsp70的基因序列,设计Akt1,Raf1,Hsp90,Hsp70的引物,利用ABI 7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct进行基因表达的相对定量分析。结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17-AAG可以下调Akt及Raf基因的表达,上调Hsp90及Hsp70基因表达。结论:应用SYBR Green实时荧光PCR可以特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17-AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。     

癫痫患者脑脊液差异蛋白质组学分析

目的应用蛋白质组学技术研究脑脊液的癫痫相关蛋白,以便从蛋白质水平揭示癫痫发生发展机制及可能的诊断标志物。方法双向凝胶电泳和质谱技术分离和鉴定癫痫组(n=8)和对照组(n=8)脑脊液的差异表达蛋白。结果约68个蛋白质点表达水平在两组间存在明显差异,选择18个差异蛋白质点质谱鉴定。除4个假想蛋白和未知功能蛋白及得到7个已知功能蛋白,涉及免疫反应、运输蛋白、能量代谢酶蛋白、细胞骨架蛋白和热休克蛋白。结论大部分被鉴定的蛋白为首次报道,这些蛋白与癫痫的发生发展相关,可能成为癫痫脑脊液分子标志物。     

类风湿关节炎湿热痹阻证血清比较蛋白组学分析

目的 应用蛋白质组学技术,开展中医湿热痹阻证证候学研究.方法 对类风湿性关节炎湿热痹阻证(n＝12)、类风湿性关节炎肝肾阴虚证(n=12)、正常对照(n=12)共三组血清,分别进行双向凝胶电泳,通过软件分别比较湿热痹阻证组和其他两组图谱,找出共同的湿热痹阻证差异蛋白质点,应用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定.结果 对14个湿热痹阻证共同的差异蛋白点,应用质谱进行鉴定和SwissProt数据库检索,得到9个湿热痹阻证差异蛋白,涉及细胞周期调控蛋白、分泌多肽、泛素蛋白酶体系统蛋白、膜蛋白质类、运输蛋白等.结论 这些蛋白具有潜在的作为类风湿性关节炎湿热痹阻证诊断、预后标志物或治疗靶点的意义,也为进一步研究湿热痹阻证实质提供了依据.     

类风湿关节炎寒湿痹阻证患者血清蛋白组学分析

目的从蛋白质表达水平初步探讨类风湿关节炎中医寒湿痹阻证的本质内涵。方法选择24例2009年7月-2010年9月南京中医药大学附属医院风湿免疫科类风湿关节炎（RA）患者,按中医辨证分型分为寒湿痹阻证组和湿热痹阻证组,每组12例,另选择本院体检中心健康志愿者12名作为正常对照组。采用双向凝胶电泳技术分析各组蛋白图谱,分别比较寒湿痹阻证组和其他两组图谱,找出共同的寒湿痹阻证差异蛋白质点,应用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定。采用Mascot软件在SwissProt数据库中搜索肽质量指纹谱数据并确定蛋白质。结果寒湿痹阻证组与正常对照组差异蛋白质点共有81个;寒湿痹阻证组与湿热痹阻证组差异蛋白质点共有45个;有13个蛋白点是寒湿痹阻证组较其他两组蛋白表达量均高或均低的蛋白点;通过质谱鉴定和数据库检索获得9个差异蛋白质。这些差异蛋白大多与细胞增殖、细胞分化等细胞事件的抑制相关。结论4．1蛋白、DLC-1蛋白等与细胞增殖和细胞分化相关蛋白具有潜在的作为类风湿关节炎寒湿痹阻证诊断、预后标志物或治疗靶点的意义,也为进一步研究寒湿痹阻证实质提供了依据。     

非小细胞肺癌组织磷酸化蛋白p27和钙网蛋白的水平研究

目的 探讨非小细胞肺癌组织磷酸化蛋白p27和钙网蛋白（CRT）的水平及其临床意义.方法 采用免疫印迹法（Western blot）检测72例非小细胞肺癌组织及对应癌旁正常组织的p27和CRT蛋白水平,分析其蛋白水平与临床病理特征的关系.结果 非小细胞肺癌组织中p27水平低于癌旁正常组织,而CRT水平却高于癌旁正常组织（P＜0.05）,两种蛋白在不同TNM分期及淋巴结转移情况上的分布差异有统计学意义（P＜0.05）,且ⅢA（TNM分期）和有淋巴结转移的p27水平较低,而CRT水平较高,且总体上p27和CRT的蛋白水平呈负相关（r=-0.663,P＜0.05）.结论 非小细胞肺癌中p27水平较低,CRT水平较高,且与TNM分期及淋巴结转移有关.     

17-AAG对人RPE细胞PDGFR和EGFR基因表达的调控

目的:通过检测17-AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17-AAG对人RPE细胞中PDGFR和EGFR基因表达的调控。方法:体外培养人RPE细胞株。当加入17-AAG并作用0,2,5,10μmol/L及0,16,24,48h后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据PDGFR、EGFR的基因序列,设计PDGFR、EGFR的引物,利用ABI7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct值进行基因表达的相对定量分析。结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17-AAG可以下调PDGFR基因的表达(P<0.05),上调EGFR基因表达(P<0.05)。结论:SYBR Green实时荧光PCR可特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17-AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。     

强直性脊柱炎湿热痹阻证血清差异蛋白组学研究

目的?应用蛋白质组学双向电泳和质谱技术,开展强直性脊柱炎湿热痹阻证证候学研究。方法?对强直性脊柱炎湿热痹阻证、寒湿痹阻证、正常对照共3组各30例血清,分别进行双向凝胶电泳,软件分析获取湿热痹阻证组和其他2组的差异蛋白质点,二级质谱鉴定获得差异蛋白。应用Western blot验证差异蛋白。结果?获得7个湿热痹阻证的共同差异蛋白点,经质谱鉴定和SwissProt数据库检索,获得Fibulin-1、二肽基肽酶1、激肽原1、白细胞介素17F突变型、甘露糖结合蛋白C等5个强直性脊柱炎湿热痹阻证差异蛋白,涉及胞外基质蛋白、蛋白酶类、凝血因子、细胞因子、转运蛋白等。Western blot验证甘露糖结合蛋白C的表达结果与蛋白组学检测结果一致。结论?这些蛋白可能涉及强直性脊柱炎湿热痹阻证的发病和病理过程,为进一步研究湿热痹阻证实质提供了依据。      

细胞质膜及其蛋白质复合物分离与定性方法研究

目的:探讨细胞质膜及其蛋白质复合物分离与定性的方法?方法:结合差速离心法?密度梯度离心法?双水相法分离得到细胞质膜,并利用透射电镜和Western blot等实验手段验证分离所得细胞质膜的纯度?结果:本文采用了蓝绿温和凝胶电泳法对细胞质膜上的蛋白质复合物进行一维分离,得到23种蛋白质复合物;接着对23种蛋白质复合物进行第二相垂直电泳分离,分离出135种蛋白质;最后鉴定78种是质膜相关蛋白,其余57种来源内膜系统?结论:多种提纯方法的联用可以有效提高蛋白分离率与分离纯度,高纯度的质膜对质膜蛋白质组的研究具有重要意义?     

乳腺癌组织EphA7蛋白和膜联蛋白A5的水平研究

目的：探讨乳腺癌组织中Eph基因家族A 7蛋白（EphA 7）和膜联蛋白A 5（ANXA 5）的表达水平及临床意义。方法采用免疫印迹法检测84例乳腺癌组织及对应癌旁组织的EphA 7和ANXA 5蛋白水平,分析两者的相关性及与乳腺癌不同临床病理特征的关系。结果乳腺癌组织中EphA 7和ANXA 5的蛋白水平均高于癌旁组织（P〈0.05）,且乳腺癌组织中两者的蛋白水平在瘤体直径、临床分期及脉管癌栓上的分布均有统计学差异,且“瘤体直径〉2 cm”、“临床分期为Ⅲ＋Ⅳ”、及“伴有脉管癌栓”的水平较高（P〈0.05）;不同淋巴结转移情况的EphA 7蛋白水平差异有统计学意义;乳腺癌组织中EphA 7和ANXA 5的蛋白水平呈正相关（r=0.715,P〈0.05）。结论乳腺癌组织中EphA 7和ANXA 5的蛋白水平较高,且与肿瘤的发生发展密切相关,有可能成为乳腺癌诊断、治疗及预后预测的重要指标。