应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离兔骨髓间充质干细胞

背景：特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化。但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。 目的：优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察。 设计、时间和地点：观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成。 材料：兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养。 方法：采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化。首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5 g/L胰酶约3.0 mL,置于37 ℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱壁的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可。按1.0×108 L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养。 主要观察指标：间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。 结果：①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞。③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱。④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞。 结论：分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强。     

磷酸钙人工骨复合骨髓基质干细胞移植修复骨缺损的实验

背景骨缺损临床常用治疗方法有自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植,但都存在不同程度的缺点.因此,如何更好的修复缺损的骨组织,成为外科领域关注的热点.目的制备磷酸钙人工骨与骨髓基质干细胞复合物,通过动物实验观察骨缺损的修复作用. 设计随机对照实验单位青岛大学医学院附属医院创伤外科.材料实验于2002-05/2003-09在青岛大学医学院附属医院动物实验中心进行.新西兰健康成年大白兔24只,6～14个月龄,体质量9～3.5kg,雌雄不限.方法①分离、扩增兔骨髓基质干细胞,并以磷酸钙人工骨为载体制备磷酸钙人工骨与骨髓基质干细胞复合物.②24只兔(48侧)制作成骨缺损模型,分为3组,复合物组(24侧),24只兔一侧骨缺损植入细胞+载体复合物;人工骨组(12侧),12只兔对侧植入磷酸钙人工骨;空白对照组(12侧),12只兔对侧骨缺损不作任何处理.术后8,16,24周,每组每个时间点取4只动物进行放射性核素监测,并分别于麻醉状态下处死相应动物,进行X射线摄片、组织学染色分析.主要观察指标①各组动物骨缺损区大体观察.②X射线检查结果.③组织形态学观察结果.④放射性核素监测结果.结果24只兔均进入结果分析.①各组动物骨缺损区大体观察及X射线检查结果24周时,复合物组骨断端部分连结,新骨与材料之间的边界不清,未见到髓腔再通;单纯人工骨组植入材料与截骨断端融合,材料体积较植入初期变化不明显;空白对照组形成骨不连,髓腔封闭.②组织形态学观察结果24周时,复合物组骨缺损范围变小,骨缺损处相连;人工骨组新骨与材料结合紧密并部分长入;空白对照组髓腔封闭,形成骨不连.③放射性核素监测结果复合物组和人工骨组8～24周间肉眼可分辨出放射性浓度呈明显上升趋势.结论磷酸钙人工骨与骨髓基质干细胞复合物可再生新骨组织并完好地修复桡骨缺损,且修复能力明显优于单纯的磷酸钙人工骨.     

两种不同移植物重建膝前交叉韧带的临床疗效比较

[目的]探讨自体髌腱与深低温冷冻同种异体髌腱重建膝关节前交叉韧带的临床疗效差异。[方法]72例ACL断裂患者于术前应用电脑随机抽样方法分为两组:A组36例为自体髌腱组,B组36例为单纯深低温冷冻保存同种异体髌腱组。两组病例均由同一术者采用标准关节镜技术完成前交叉韧带重建。通过一般情况比较、轴移试验、Lachman试验、Daniel单腿水平跳跃试验、IKDC评分、Lysholm-Tegner运动水平评分及KT-2000检测评价临床疗效。[结果]70例患者获得随访,平均随访时间A组(36例)39.5个月、B组(34例)36.3个月,2例失访。A组发生术中髌骨骨折1例、术后髌前痛2例,B组出现迟发感染1例。A组平均手术时间较B组长,术后发热天数较B组短。两组住院时间无差异。A、B两组轴移试验、Lachman试验及KT-2000检测的差异无统计学意义。A、B两组ACL重建失败率分别为8%、9%,差异无统计学意义。两组间Daniel单腿水平跳跃试验、IKDC评分及Lysholm-Tegner运动水平评分的差异无统计学差异。[结论]单纯深低温冷冻同种异体髌腱与自体髌腱相比较,重建前交叉韧带的术后短期疗效接近,可作为自体移植物重建前交叉韧带的一个良好的移植替代物。     

骨髓间充质干细胞向计旺样细胞的体外分化：富血小板有明确的诱导效应吗？

目的：研究间充质干细胞在体外向雪旺样细胞分化的可行性并对细胞的分泌功能进行检测。方法：取第3代生长状态良好的间充质干细胞,联合诱导组通过β-巯基乙醇（β-ME,第1d）和维甲酸(RA,第2-4d)序贯诱导后用含富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）的完全培养基培养7d,用荧光染色法对S-100进行鉴定,并于培养的第4d、第7d、第9d和第11d在细胞换液前收集培养液,用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测NGF的含量,于培养的第11d收集细胞进行RT-PCR试验以检测NGF mRNA的表达,并和单纯诱导组（通过β-巯基乙醇和维甲酸序贯诱导后用不含PRP的完全培养基培养）和空白对照组（不进行诱导,培养方法和MSC的培养方法）比较。结果：体外经诱导间充质干细胞发生形态上的改变并表达S-100蛋白,联合诱导组和单纯诱导组细胞的培养液中均能检测到含量较高的NGF,第4d时与对照组比较差异有极显著意义（P＜0.01,P＜0.01）。NGF的含量在第7d、第9d、第11d天联合诱导组明显高于单纯诱导组,差异有显著意义（P＜0.05）。联合诱导组和单纯诱导组均表达NGF mRNA,联合诱导组表达强度更加明显,差异有显著意义（P＜0.05）。结论：间充质干细胞体外能诱导分化为雪旺样细胞,且具有分泌NGF的功能,经诱导后用PRP处理能明显提高诱导的效率。     

俯卧撑训练致臂丛神经损伤1例

1病例报告男，18岁，某部新战士。因持续俯卧撑训练，导致左肩、左上肢功能障碍10d以后收住院。专科检查：左三角肌明显萎缩，左肩不能主动外展。肌力检查：三角肌0级，肱三头肌、伸腕肌3级，肽桡肌3级，伸指肌4级，其余肌力正常，上肢皮肤感觉正常。肌电图检查：冈上肌、三角肌、肱桡肌静息时可见纤颤电位，用力收缩时为混合相，电压0．8mV，时程16ms，体感诱发电位（SEP）1～9潜伏期延长，提示臂丛神经不完全损伤。诊断：左臂丛神经不完全损伤（腋神经较著）。入院后经理疗、维生素BI等治疗1个月，功能完全恢复。2讨论上臂丛神经，尤其…     

肌腱愈合过程中转化生长因子β1基因表达的变化

目的研究兔屈趾肌腱Ⅱ区伤口愈合过程中转化生长因子β1（transforming growth factorpβ1，TGF-β1）基因表达的变化。方法取成年新西兰大白兔60只，体重4．0～4．5kg，将左前中趾屈趾深肌腱切断并采用标准Kessler缝合法修复作为实验组，分别于术后1、7、14、21、28及56d获取肌腱及腱鞘进行观察，每个时间点取10只；同一动物的右前肢正常肌腱及腱鞘作为对照组。采用原位杂交和免疫组织化学染色分析TGF—β1的表达情况。结果原位杂交结果示：实验组TGF—β1mRNA在术后1d开始上调，14～21d达高峰，56d保持较高水平；对照组存在TGF—β1mRNA的表达，但表达水平较低；实验组各时间点TGF—β1mRNA表达与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈O．05）。免疫组织化学染色：实验组术后1d，TGF—β1蛋白信号的表达增加，14～21d达高峰，56d仍保持一定水平；对照组术后各时间点存在TGF—β1蛋白信号表达，但表达水平较低。结论正常无损伤的肌腱和腱鞘能产生TGF—β1，当肌腱损伤后，细胞因子被激活，增加的细胞因子主要由肌腱细胞与腱鞘细胞产生，与肌腱的内、外源性愈合机制是一致的。     

胚胎浸液促进鸡骨折愈合的实验

将健康人3个月内人工流产的全胚胎,按常规冷藏组织液制备方法制成胚胎浸液.将30只鸡以手法造成尺骨骨折.随机分配成数目相等的实验组和对照组,实验组骨折端注入胚胎浸液.骨折后血清碱性磷酸酶(ALP)及皮质外新生骨体积测定结果,实验组明显高于对照组;骨折端组织切片光镜检查见实验组骨折愈合质量明显好于对照组.结果提示胚胎浸液有促进骨折愈合的作用.     

介绍一种自制的克氏针打入器

在骨科用克氏针做内固定时，因克氏计直径较小，针体柔软，故不能直接打入，否则会引起克氏针弯曲变形及打入方向的偏斜。目前均采用钻入法，须加配体积较大的导向架，操作不便。为此，作者设计出一种克氏外打火器。原理：将克氏针装入直径稍大于克氏针的套管中，用撞杆将克氏针直接打入骨中。由于套管对克氏外有环形强制约束作用，在打入时克氏针不能发生弯曲变形；由于撞杆亦同时放入套管中，打击时，撞杆的作用力始终保持与克氏针轴线一致。这二者的作用可保证克氏针在打入时不会弯曲变形。制作方法：打火器由套管和撞杆组成，结构剖面如…     

应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离免骨髓间充质干细胞

背景:特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化.但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提.目的:优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察.设计、时间和地点:观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成.材料:兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养.方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化.首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5 g/L胰酶约3.0 mL,置于37℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱肇的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可.按1.0X 108L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养.主要观察指标:间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.结果:①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构.②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞.③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱.④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞.结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强.