胰岛素样生长因子-1对骨骼肌源性干细胞的促增殖效应

目的 观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对骨骼肌源性干细胞(MDSCs)生长的影响.方法 采用连续预贴壁法从新生小鼠后肢肌分离培养MDSCs;用含2%胎牛血清的DMEM培养基促进其向骨骼肌细胞分化.免疫细胞化学SP法检测于细胞标志Sca-1和骨骼肌细胞标志肌节(α-sarcomeric)肌动蛋白的表达情况;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测IGF-1对MDSCs增殖的影响,并分析IGF-1效应与培养时间以及与IGF-1浓度之间的关系.结果 从新生小鼠后肢肌成功分离培养MDSCs,90%以上的MDSCs呈Sca-1阳性;在分化培养中MDSCs能够产生α-sarcomeric 肌动蛋白阳性的肌管;IGF-1对MDSCs促增殖作用随细胞培养时间的延长逐渐明显;随IGF-1浓度的增加而增加,并逐渐趋于饱和.结论 IGF-1对体外培养的MDSCs有促进增殖的作用.     

干细胞向运动神经元诱导分化的特点

目前研究证明胚胎干细胞和神经干细胞可以诱导分化为运动神经元,诱导主要方法是在培养过程中加入诱导因子,从而提高分化培养中运动神经元的分化比例.运动神经元在体外培养中发育成熟的过程与其在胚胎内发育过程类似,也有Pax6、Nkx6.1、Olig2和HB9等转录因子的参与,其中以HB9为分选标志的细胞在体外几乎完全分化为运动神经元.此外,还有其他种类的蛋白标志用到运动神经元的诱导分化鉴定中,如神经元标志MAP-2、β-tubulin-Ⅲ,胆碱能细胞标志ChAT、VAChT,许旺细胞有丝分裂原REG2,电压依赖性钙离子通道亚单位等.运动神经元诱导分化的鉴定除了上述特异性分子标志表达的检测外,还需检验分化的运动神经元是否具有功能.运动神经元功能的检测方法可分为两类,一是检测体外培养中的运动神经元是否具有功能,二是检测分化的运动神经元移植到动物体内是否也同样具有功能.干细胞诱导分化为运动神经元方法已基本成熟,但距临床应用还有很多问题需要进一步讨论,如关于运动神经元诱导分化的细胞来源、运动神经元诱导分化的效率、分化运动神经元的纯化、运动神经元的功能等.     

Nogo受体慢病毒干扰载体在大鼠神经干细胞中的表达及其干扰效率鉴定

目的 在体外分离培养的大鼠神经干细胞内,通过慢病毒介导的shRNA实现持续稳定的NgR沉默。方法 设计并合成表达NgR shRNA的慢病毒载体,通过转染293T细胞系收集包装好的病毒颗粒。分离培养初生大鼠脊髓神经干细胞,以不同MOI值感染慢病毒,流式细胞术确定感染所需的最佳MOI值。感染慢病毒的神经干细胞经潮霉素筛选后进行单克隆培养,Western blot法检测NgR的沉默效率。取感染后不同天数的神经干细胞,实时定量PCR检测NgR沉默的稳定性。结果 神经干细胞分离培养6天后可见神经球形成;流式细胞术测定慢病毒感染的最佳MOI=10;慢病毒感染后NgR的沉默效率可达80%,并可在7~28天内维持在70%~80%。结论 慢病毒介导的shRNA可以在体外分离培养的大鼠神经干细胞内实现较为稳定的NgR基因沉默,为开展神经干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。     

新生小鼠端脑神经干细胞可诱导分化为运动神经元

目的 探讨新生小鼠端脑神经干细胞诱导分化为运动神经元的可能性,并探索新的运动神经元诱导因子.方法 用悬浮培养法从新生小鼠端脑分离培养神经干细胞,按诱导因素的不同分为3组:组1为对照组,诱导因素为生长培养基+5%胎牛血清(FBS);组2为诱导因子组,诱导因素为生长培养基+5% FBS+视黄酸(RA)+Shh+联丁酰基环磷酸腺苷(dbcAMP);组3为骨骼肌细胞培养液组,诱导因素为骨骼肌细胞生长过的培养液.用双重免疫荧光方法检测分化细胞的微管相关蛋白2(MAP2)和同源蛋白(HB9)的表达,以验证运动神经元的分化,每组随机选取12个标本计数.结果 分化培养中检测到MAP2和HB9共表达的运动神经元,组1的运动神经元分化比例为1%;组2的分化比例为4.7%;组3的分化比例为2.9%.与组1相比有显著的统计学差异.结论 新生小鼠端脑神经干细胞能诱导分化为运动神经元;骨骼肌细胞可能分泌运动神经元诱导因子.     

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对骨骼肌源性干细胞的促增殖效应

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）单独及联合应用对骨骼肌源性干细胞（muscle derived stem cells，MDSCs）生长的影响。方法取出生24h内的昆明小鼠15只，采用连续预贴壁法从小鼠后肢肌分离培养MDSCs，用含2％胎牛血清的DMEM培养基促进其向骨骼肌细胞分化。取原代MDSCs及MDSCs分化细胞，采用免疫细胞化学染色检测干细胞标志Sca-1和骨骼肌细胞标志α-Sarcomeric肌动蛋白的表达。HE染色观察细胞肌管形成。MTT比色法检测不同浓度（6．25、12．50、25．00、50．00、100．00ng／ml）的bFGF和EGF单独应用96h对MDSCs增殖的影响以及二者（100．00ng／ml）联合作用24、48、72和96h对MDSCs增殖的影响。结果从新生小鼠后肢肌成功分离培养MDSCs，免疫细胞化学染色90％以上的MDSCs呈Sca-1阳性，分化形成的肌管呈α—Sarcomeric肌动蛋白阳性。HE染色可见肌管形成。bFGF、EGF对MDSCs的促增殖效应随浓度的增加而增加。与阴性对照组比较，bFGF于12．50ng／ml出现促增殖效应（P〈0．05）；25．00ng／ml组与12．50ng／ml组比较，作用提高（P〈0．01）；50．00、100．00ng／ml组较25．00ng／ml组无明显提升（P〉0．05）；EGF的作用与bFGF类似，但于50．00ng／ml时趋于饱和。与阴性对照组比较，EGF于72h、bFGF于96h表现促增殖效应（P〈0．01），而二者联合应用于24h即表现促增殖效应（P〈0．01），并于48、72和96h增殖效应均较单独应用显著提高（P〈0．05）。结论bFGF和EGF都能促进MDSCs的增殖，联合作用更快、更强。     

新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。     

靶向大鼠Nogo受体基因的小发夹RNA慢病毒载体的构建及病毒包装

目的构建靶向大鼠Nogo受体(NgR)的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并进行病毒颗粒包装及滴度测定。方法设计合成3对针对大鼠NgR及1对非特异性的寡核苷酸单链,退火后得到shNgR双链,克隆入慢病毒载体pGC-LV,行聚合酶链反应(PCR)并测序鉴定重组体;构建NgR过表达载体,双酶切并测序鉴定插入序列正确性;NgR过表达载体和各慢病毒shRNA干扰载体共转染293T细胞后,定量反转录(RT)-PCR及蛋白印迹法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体;重组NgR慢病毒shRNA干扰载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,包装并收集病毒颗粒,进行病毒浓缩液滴度检测。结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGC-LV-shNgR构建正确;双酶切及测序亦显示NgR过表达载体插入序列正确;定量RT-PCR及蛋白印迹法结果表明所构建的3个慢病毒载体pGC-LV-shNgR均可以有效干扰NgR的表达,其中pGC-LV-shNgR-A干扰效率最高;包装病毒颗粒后,检测病毒浓缩液的滴度为2×107 TU/mL。结论成功构建靶向大鼠Nogo受体的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装,浓缩的病毒液可以用于后续研究。     

干细胞向运动神经元诱导分化的特点*☆

目前研究证明胚胎干细胞和神经干细胞可以诱导分化为运动神经元，诱导主要方法是在培养过程中加入诱导因子，从而提高分化培养中运动神经元的分化比例。运动神经元在体外培养中发育成熟的过程与其在胚胎内发育过程类似，也有Pax6、Nkx6.1、Olig2和HB9等转录因子的参与，其中以HB9为分选标志的细胞在体外几乎完全分化为运动神经元。此外，还有其他种类的蛋白标志用到运动神经元的诱导分化鉴定中，如神经元标志MAP-2、β-tubulin-Ⅲ，胆碱能细胞标志ChAT、VAChT，许旺细胞有丝分裂原REG2，电压依赖性钙离子通道亚单位等。运动神经元诱导分化的鉴定除了上述特异性分子标志表达的检测外，还需检验分化的运动神经元是否具有功能。运动神经元功能的检测方法可分为两类，一是检测体外培养中的运动神经元是否具有功能，二是检测分化的运动神经元移植到动物体内是否也同样具有功能。干细胞诱导分化为运动神经元方法已基本成熟，但距临床应用还有很多问题需要进一步讨论，如关于运动神经元诱导分化的细胞来源、运动神经元诱导分化的效率、分化运动神经元的纯化、运动神经元的功能等。     

两种神经球制片方法的比较研究

目的 探讨两种神经球制片方法--贴片法和切片法的差异,并初探神经球内部的细胞结构.方法 分离培养新生小鼠端脑神经干细胞,收集原代或传代培养7 d的神经球用于制片;贴片法是将神经球整体贴于载玻片上,切片法是将神经球用OCT包埋,冷冻切片机切片;通过比较两种制片方法的巢蛋白(nestin)免疫荧光染色的差异说明两种制片方法的差异;用HE染色方法将神经球切片染色,进一步观察其内部结构.结果 成功分离培养的新生小鼠端脑神经干细胞在体外培养中形成神经球;贴片法制片神经球表面细胞染色良好,内部细胞不能着色,而且细胞形态显示不清晰,切片法制片神经球表面和内部细胞均能着色,细胞形态显示清晰:HE染色见神经球细胞之间借助突起相互连接,形成错综复杂的细胞网络.结论 切片法制片较贴片法制片更有利于神经球的形态学研究;神经球是一个复杂的立体的细胞生长模式.