MST1启动子区DNA低甲基化在ApoE－/－小鼠肾损伤中的作用

目的探讨哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)及其DNA甲基化在载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠肾损伤中的作用及意义。方法实验动物分为2组:(1)Apo E-/-组(n=10):雄性Apo E-/-鼠饲以高蛋氨酸饮食;(2)对照组(n=10):雄性C57BL/6J鼠饲以高蛋氨酸饮食。喂养14周后,全自动生物化学分析仪测定小鼠血清肌酐和尿素氮水平;PAS染色及透射电子显微镜观察小鼠肾脏组织损伤情况;实时定量PCR及Western blot分别检测小鼠肾脏中MST1 mRNA和蛋白表达水平。巢式甲基化特异性PCR(n MS-PCR)检测小鼠肾脏MST1 DNA甲基化水平。结果与对照组比较,Apo E-/-组血清肌酐和尿素氮分别升高了1.1倍和1.6倍(P0.01);PAS染色和透射电镜结果显示,Apo E-/-组较对照组肾脏明显损伤;Apo E-/-小鼠肾脏MST1表达分别与血清肌酐和尿素氮水平呈正相关(R2=0.7571,P=0.0012;R2=0.7342,P=0.0015);n MS-PCR结果显示,Apo E-/-组肾脏中MST1 DNA甲基化水平较对照组显著降低(P0.01)。结论 MST1表达上调可能在Apo E-/-小鼠肾损伤中发挥重要作用,而MST1启动子区DNA低甲基化改变可能是MST1表达上调的重要机制。     

衰老大鼠心肌组织中活性氮簇的改变及可能意义

目的测定衰老大鼠心肌组织凋亡程度,探讨及测定衰老大鼠心肌组织中活性氮簇的改变及其与心肌细胞凋亡的关系。方法分别选取雄性成年SD大鼠（4月龄-6月龄）和衰老SD大鼠（22月龄-24月龄）。采用Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中细胞凋亡发生情况,用Western-blot蛋白印记法检测大鼠心肌组织中血管舒张剂刺激的磷蛋白（VASP）和磷酸化VASP（pVASP）的表达水平;ELISA法检测心肌组织硝基酪氨酸含量。结果与成年大鼠相比,衰老大鼠的Caspase-3比活性显著增高（P〈0.01）,心肌组织pVASP水平明显降低（P〈0.01）,硝基酪氨酸明显升高（P〈0.05）,硝基酪氨酸含量与Caspase-3活性呈正相关。结论衰老大鼠心肌组织中一氧化氮生物利用度下降,生成大量毒性的过氧亚硝基,这可能是衰老心脏凋亡增加的原因之一。     

机械创伤使大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性增加

目的 观察机械创伤大鼠对心肌缺血/再灌注损伤的敏感性.方法 用Noble -Collip创伤仪制备机械创伤模型,采用完全随机分组方法将Wistar大鼠分为假创伤组、创伤组、假创伤+假手术组、假创伤+缺血/再灌组和创伤+缺血/再灌组,于创伤后1周行缺血/再灌注.采用BL - 410生物信号记录分析系统记录大鼠左心室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室压力上升和下降最大速率(±dp/dtmax)等心功能数据;采用双抗体夹心ABC -ELISA法检测大鼠血清肌酸激酶同工酶MB( CK - MB)、心肌肌钙蛋白(cTnI)水平;缺血/再灌注后心脏通过伊文思蓝染色、2,3,5 -氯化三苯基四氮唑(TTC)复染后,用Image - Pro Plus 6.0图像分析软件进行心肌梗死面积测定.结果 创伤+缺血/再灌注组在体心功能明显低于假创伤+缺血/再灌注组(P＜0.01);创伤+缺血再灌注组血清CK - MB和cTnI水平显著高于假创伤+缺血/再灌注组[ CK - MB:(4 960±588) ng/ml:(2 925±426) ng/ml,P＜0.01;cTnI:( 18.10 ±3.06) ng/ml:(6.67±1.57) ng/ml,P＜0.01];创伤+缺血/再灌注组心肌梗死面积明显大于假创伤+缺血/再灌注组[(36.70±7.42)％:(22.27±4.54)％,P＜0.01].结论机械创伤使大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性增加.     

成年大鼠心肌缺血再灌注后X染色体连锁凋亡抑制蛋白的动态表达变化

目的 测定心肌缺血再灌注过程中X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）动态表达变化,探讨其与缺血再灌注损伤所致心肌细胞凋亡的关系.方法 将健康成年雄性SD大鼠随机分为两组,手术组和伪手术组,每组根据再灌注时间再分为6组：缺血30min,再灌注0、1、2、3、12、24 h组.采用半胱天冬酶-3（Caapaae-3）活性检测判定大鼠心肌细胞凋亡发生情况;用Western Blot和实时定量PCR技术分别检测各组心肌组织中XIAP的蛋白和基因表达水平.结果 Caspase-3活性从心肌缺血再灌注1 h开始升高,再灌注12 h活性最大,再灌注24 h趋于正常.心肌缺血再灌注3 h,XIAP蛋白表达开始降低,再灌注12 h表达最低;而XIAP的mRNA水平表达各组差异无统计学意义.结论 成年大鼠心肌缺血再灌注后Caspase-3活性增高可能与XIAP表达降低有关,提示XIAP表达降低可能参与了心肌缺血再灌注诱导的细胞凋亡.     

MMP-9/TIMP-1在HHcy致ApoE－/－小鼠肾脏损伤中的作用机制

目的探讨高同型半胱氨酸血症(HHcy)导致Apo E-/-小鼠肾脏损伤的作用机制,为HHcy所致肾脏疾病的预防和治疗提供理论和实验依据,为肾病患者的疾病监测提供新的指标。方法将5周龄雄性纯合子Apo E-/-小鼠随机分组:Apo E-/-对照组饲以普通饮食,Apo E-/-高蛋氨酸组饲以高蛋氨酸饮食,Apo E-/-干预组饲以加叶酸和维生素B12的高蛋氨酸饮食,5周龄SPF级C57BL/6J雄鼠饲以普通饮食作为正常对照组,喂养14周后,生化分析仪测定血清同型半胱氨酸(Hcy)、肌酐及尿素浓度,透射电镜和PAS染色检测小鼠肾脏损伤情况,荧光定量PCR检测肾脏基质金属蛋白酶9(MMP-9)和组织型基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)m RNA表达水平,并以免疫组织化学染色法分析肾脏MMP-9蛋白表达,ELISA检测TIMP-1蛋白表达。结果与正常对照组相比,Apo E-/-高蛋氨酸组血清Hcy、肌酐及尿素浓度分别升高了3.66倍、1.1倍和1.6倍(P0.01);透射电镜和PAS染色结果显示,Apo E-/-高蛋氨酸组较正常对照组肾脏损伤明显,荧光定量PCR结果显示MMP-9及TIMP-1 m RNA表达则分别升高了5.25倍和1.38倍(P0.01);免疫组织化学结果显示Apo E-/-高蛋氨酸组MMP-9表达较正常对照组明显升高(P0.01);ELISA结果显示Apo E-/-高蛋氨酸组TIMP-1蛋白表达比正常对照组明显升高(P0.01)。与Apo E-/-高蛋氨酸组相比,Apo E-/-干预组血清Hcy浓度下降,且肌酐和尿素浓度均降低(P0.01);透射电镜和PAS染色结果显示,Apo E-/-干预组肾脏损伤较Apo E-/-高蛋氨酸组减轻。血清Hcy浓度与其肌酐及尿素浓度呈正相关(r2=0.4344,P0.0001;r2=0.4478,P0.0001),与MMP-9/TIMP-1比值也呈正相关(r2=0.39309,P0.001),且小鼠肾脏MMP-9/TIMP-1比值与肌酐及尿素浓度也成正相关(r2=0.1464,P0.05;r2=0.3027,P0.01)。结论 HHcy可能是经MMP-9/TIMP-1比例上调致细胞外基质降解,继而导致肾脏损伤。     

同型半胱氨酸致泡沫细胞形成过程中miR-148a与DNMT1相互作用的研究

【目的】 探讨DNMT1和其特异性miRNA二者在Hcy致泡沫细胞形成过程中的作用,阐明特异性miRNA与DNMT1相互调控的分子机制。 【方法】 培养THP-1单核源性泡沫细胞,油红O染色鉴定;生物信息学预测调控DNMT1的特异性miRNA;运用qRT-PCR和Western Blot检测不同浓度Hcy(0、50、100、200、500 μmol/L)及100 mol/L Hcy+叶酸+维生素B₁₂(H+F+V)干预泡沫细胞后,miR-148a和DNMT1的表达。使用慢病毒miR-148a mimic和inhibitor分别过表达和抑制miR-148a,检测其对DNMT1表达的影响;针对miR-148a与DNMT1特异性结合的碱基位点,构建野生型(Wt)和突变型(Mut)的3'UTR荧光素酶报告质粒,与miR-148a mimic共转染,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测DNMT1荧光素酶活性。采用胆固醇检测试剂盒分析miR-148a过表达或抑制后对细胞内胆固醇含量的影响。用100 mol/LHcy干预泡沫细胞,通过甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测miR-148a启动子区甲基化改变,同时构建DNMT1重组质粒并感染泡沫细胞,检测DNMT1过表达后miR-148a启动子区DNA甲基化变化。 【结果】 分析提示调控DNMT1的特异性miRNA为miR-148a;不同浓度Hcy干预泡沫细胞后,DNMT1表达降低,miR-148a表达升高,以100 μmol/L Hcy组改变最为明显,差异均有显著性(P<0.05);给予100 μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12后上述情况改善(P<0.05)。过表达miR-148a后DNMT1 mRNA和蛋白水平明显下降,而抑制miR-148a后DNMT1 mRNA和蛋白水平明显升高,差异均有显著性(P<0.05)。将WtDNMT1 3'UTR荧光素酶报告质粒与miR-148a共转染,荧光素酶活性显著下降(P<0.05);将MutDNMT1 3'UTR荧光素酶报告质粒与miR-148a共转染,荧光素酶活性无明显改变。提示miR-148a可能通过与DNMT1的mRNA 3'UTR碱基UGCACUG发生互补配对结合,从而靶向抑制其表达。过表达miR-148a后,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量明显增加;沉默miR-148a后,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量明显降低(P均<0.05);而细胞内胆固醇酯含量无明显变化。给予100 μmol/L Hcy干预泡沫细胞后,miR-148a甲基化呈显著下降趋势;给予叶酸+维生素B12干预后,miR-148a甲基化水平较Hcy显著升高(P均<0.05)。过表达DNMT1后,miR-148a启动子区DNA甲基化水平升高(P<0.05)。 【结论】 miR-148a是DNMT1的特异性miRNA,其可能通过直接与DNMT1 3'UTR部分碱基序列UGCACUG发生互补配对结合影响DNMT1表达;miR-148a可通过增加泡沫细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量参与Hcy致泡沫细胞的形成过程;DNMT1在miR-148a启动子区甲基化过程中发挥重要作用。     

ERO1α启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化相互作用调控ERO1α表达改变介导Hcy致肝脏脂代谢紊乱的分子机制

【目的】 探讨ERO1α DNA甲基化和组蛋白甲基化相互作用调控ERO1α基因表达介导同型半胱氨酸致肝脏脂代谢紊乱的分子机制。 【方法】 建立apoE-/-小鼠HHcy模型,分为对照组、ApoE-/-对照组、HHcy组和干预组。检测肝脏脂质沉积情况、TC、TG及DNMT1含量、ERO1α 及G9a的表达;ntMS-PCR法检测ERO1α DNA甲基化改变;CHIP-qPCR法检测H3K9me2含量;不同Hcy刺激HL-7702肝细胞,验证ERO1α表达及甲基化程度;构建ERO1α和DNMT1的重组表达及沉默载体,检测肝细胞内TC和TG含量变化;AZC及Bix01294干预细胞后,分别检测H3K9me2表达及ERO1α甲基化水平。 【结果】 HHcy组小鼠肝脏脂质面积和血脂水平显著高于对照组,TC、 TG与其血清Hcy水平呈正相关。与对照组相比,各组中ERO1α的表达下降,与HHcy组相比,干预组中ERO1α表达升高,均与蛋白检测结果趋势一致;HHcy组DNMT1及G9a表达显著高于对照组,HHcy组中ERO1α甲基化水平及H3K9me2显著高于对照组。各组中ERO1α的表达逐渐下降,与Hcy呈浓度依赖关系;其中,与100 μmol/L Hcy组比较,叶酸组中ERO1α的表达升高,差异有统计学意义。分别过表达和沉默ERO1α并以Hcy作用后,与对照组相比,ERO1α过表达组TC和TG分别下降48.5%和38.1%,沉默组分别增加39.3%和46.4%。分别过表达和沉默DNMT1,结果显示,与对照组比较,过表达DNMT1后ERO1α甲基化水平增加15.9%,沉默组则下降55.9%,差异均有显著性。AZC抑制DNMT1并以Hcy干预后,抑制剂组与100 μmol/L Hcy组比较,ERO1α DNA甲基化水平降低了51%,H3K9me2水平随之降低;Bix01294干预后,100 μmol/L Hcy+Bix01294组与100 μmol/L Hcy组比较ERO1α启动子区H3K9me2水平降低,ERO1α甲基化水平随之降低。 【结论】 HHcy调控ERO1α启动子区DNA甲基化,和组蛋白甲基化相互作用导致ApoE-/-鼠肝脏脂代谢紊乱。     

维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。