应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立小窝蛋白1(CAV-1)基因敲除的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y),并验证其对流行性乙型脑炎病毒(JEV)的易感性。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,基于人源CAV-1基因的外显子区(EXON)序列设计小向导RNA(sgRNA),将sgRNA连接到载体PX459质粒上。将重组质粒转染至SHSY5Y细胞中,使用嘌呤霉素筛选稳定敲除CAV-1蛋白的SH-SY5Y细胞,并用免疫印迹法验证CAV-1蛋白的敲除效果。免疫荧光法比较CAV-1基因敲除的SH-SY5Y株与野生型细胞株对JEV感染性的差异。结果经酶切和测序鉴定,重组真核表达质粒构建正确,转染并筛选的单克隆细胞中没有CAV-1蛋白的表达,成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株。与野生型SH-SY5Y细胞株相比,CAV-1基因敲除的细胞株对JEV的感染性下降约90%(P0.001)。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株,该细胞株可用于进一步研究CAV-1蛋白在JEV感染中的作用机制。     

疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症的可能机制与研究进展

2019年底至今,严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎在全球范围内广泛传播,严重威胁着人类的生命安全.目前,尚无针对SARS-CoV-2的特效抗病毒药物,疫苗接种成为最有效且经济的防控手段.随着疫苗大量接种与后续随访工作的展开,与疫苗相关的自发性肝素诱导血小板减少症即疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症(vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia,VITT)在临床上陆续出现.本文就VITT的可能机制与研究进展作一综述.     

2019新型冠状病毒肺炎治疗研究现状

2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)是继严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus,SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome-coronavirus,MERS-CoV)后出现的一种能引起人严重呼吸道疾病的新型冠状病毒。目前尚无特异性的靶向2019-nCoV的抗病毒治疗药物,面对新型冠状病毒肺炎日益严重的疫情和迫切需要解决的药物治疗策略,本文对新型冠状病毒肺炎抗病毒治疗研究现状与进展进行综述。     

疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症的可能机制与研究进展

2019年底至今,严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎在全球范围内广泛传播,严重威胁着人类的生命安全。目前,尚无针对SARS-CoV-2的特效抗病毒药物,疫苗接种成为最有效且经济的防控手段。随着疫苗大量接种与后续随访工作的展开,与疫苗相关的自发性肝素诱导血小板减少症即疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症（vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia, VITT）在临床上陆续出现。本文就VITT的可能机制与研究进展作一综述。     

JEV和EV71感染SH-SY5Y细胞内吞途径的初步研究

目的初步探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染人神经细胞的内吞途径机制。方法通过蛋白酶K实验检测JEV和EV71感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的入侵速率。采用MTT法检测针对不同内吞途径关键分子的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)以及化学抑制剂对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。用JEV和EV71感染si RNA或化学抑制剂预处理的SH-SY5Y细胞,荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测不同处理对两种病毒m RNA和靶蛋白表达的影响。结果确定针对网格蛋白重链的si RNA(si CHC)最高工作浓度为50 nmol/L,针对小窝蛋白1的si RNA(si CAV1)的最高工作浓度为100 nmol/L。q RT-PCR结果显示,si CHC转染神经细胞能抑制EV71 m RNA的表达(t=17.153,P0.01),但不能抑制JEV m RNA的表达(P0.05);而si CAV1转染神经细胞能抑制JEV m RNA的表达(t=11.406,P0.01),但不能抑制EV71 m RNA的表达(P0.05)。针对网格蛋白途径的化学抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)可抑制EV71 m RNA的表达(t=4.114,P0.05),且呈剂量依赖性,而氯丙嗪并不影响JEV m RNA的表达(P0.05);针对小窝途径的化学抑制剂非律平(Filipin)可抑制JEV m RNA的表达(t=4.064,P0.05),且呈剂量依赖性,而非律平并不影响EV71 m RNA的表达(P0.05),与si RNA结果相一致。结论初步推测JEV入侵人神经细胞是通过小窝蛋白1依赖性的内吞作用入胞,而EV71感染人神经细胞则是通过网格蛋白依赖型的内吞途径。