携带 EGFPC3 质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的表达

目的 构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达.方法 将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达.结果 在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达.在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的.用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变.免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达.结论 表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型.     

质粒DNA经胃肠道吸收整合宿主基因组的可能性评价

给小鼠灌胃裸pcDNA3s质粒DNA,于3周后提取小鼠肺、肾、脾、肠系膜淋巴结、胸腺、生殖器官、肌肉及肝脏组织中的总DNA,琼脂糖凝胶分离游离质粒DNA与基因组DNA,以组织基因组DNA为模板,PCR法检测质粒DNA的整合率.对照模板中加入不同拷贝数的pcDNA3s质粒,确定PCR反应的敏感性.结果表明,各组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,低于PCR反应的最低检出率.pcDNA3s质粒可能整合入宿主基因组的拷贝数是基因自发突变率的1/3000,尚未发现外源质粒DNA经胃肠道途径整合入宿主基因组的证据.     

携带pEGFPC3的减毒鼠伤寒沙门氏菌在雏鸡体内的表达

构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pEGFP-C3,检测了PEGFP-C3在雏鸡体内荧光表达.将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL8786/pEGFP-C3分别灌胃饲服3日龄雏鸡,结果表明,在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传20代后,单个菌落和菌液均呈淡绿色.流式细胞仪结果证实,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入脾脏细胞,并在其中表达.在体内稳定试验中,经雏鸡连续传代12次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的.用免疫剂量的重组细菌接种雏鸡后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变.免疫一定时间后,在雏鸡肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达.表达PEGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌在鸡体产生荧光表达,为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型.     

携带pcDNA3s与EGFPC3质粒的重组减毒沙门氏菌的免疫性与EGFP的表达

目的研究HBsAg DNA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的免疫性与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因EGFPC3在小鼠体内的表达。方法将质粒pcDNA3s与pEGFPC3分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3与SL8786/pcDNA3s。利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体的含量,以及重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用荧光显微镜观察EGFPC3表达。结果口服SL8786/p cDNA3s免疫小鼠后,可诱导产生较强的特异性CTL应答。口服免疫小鼠后第11周抗-HBs含量最高。用流式细胞术检测贴壁培养的2只小鼠的脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20%和17.36%,而SL8786/pcDNA3口服的2只小鼠脾细胞中的EGFP阳性率分别仅为1.95%和1.63%。给小鼠口服SL8786/EGFPC33周后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠及肌肉等组织中,均有EGFPC3的表达。结论口服SL8786/pcDNA3s在小鼠体内诱导了特异性细胞和体液免疫应答。携带EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3在小鼠的部分组织中产生绿色荧光表达,该重组菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体基因工程疫苗的研制提供了一个优良模型。     

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组HBsAg口服疫苗构建与鉴定

采用大量培养含有pcDNA3s的大肠杆菌，提取pcDNA3s质粒，利用电转化方法将pcD—NA3s质粒转化到感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌，SDS—PAPG检测到930bp大小的条带，基因序列分析到重组菌含有乙肝表面抗原（HBsAg）基因序列；观察重组菌体外传代培养的稳定性，该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代。试验结果表明，携带HBsAg的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X8786／pcDNA2s已成功构建，为研究和应用人和动物治疗用乙型肝炎痛毒口服基因工程活疫苗奠定了基础。