云南省间日疟患者G6PD基因编码区的突变分析

目的分析云南省间日疟患者的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因编码区突变多态及其与伯氨喹性溶血现象易发的规律。方法收集云南省2018年经"氯喹/伯氨喹八日疗法"治疗的间日疟病例血样。以服用伯氨喹期间患者出现"茶色"尿液体征、G6PD酶活性下降判断为伯氨喹诱发急性溶血。提取血样的人基因组DNA,PCR分别扩增含G6PD基因的12个外显子片段并测序。与G6PD基因非突变型序列比对,用DNAStar11.0、BioEdit 7.2.5等软件整理、拼接测序序列获得G6PD基因的cDNA序列。用MEGA 5.04、DnaSP 5.10软件分析cDNA序列的突变多态、选择效应等。计算突变多态与伯氨喹诱发性溶血发生的相关性系数(r)和比值比(OR)。结果共收集间日疟患者血样184份,获得44份血样的G6PD基因完整cDNA链(长度为1545 bp),其中1条来自溶血病例的基因组。44条c DNA链与非突变型序列比对的突变位点包括c.461 T>A、c.574 C>T、c.786 C>T、c.1059 C>T、c.1311 T>C和c.1376 G>T,频率分别为1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、45.6/10万和1.5/10万。c.1311和c.1376的双位点突变连锁仅存在于溶血病例的基因组,且c.1376位点突变与伯氨喹性溶血的发生为正相关关系(r=1.000,P>0.05)。44条cDNA链定义为6种单倍型(Hap1~Hap6),单倍型期望杂合度(He)、核酸多样性指数(π)、Ka/Ks比值分别为0.493、0.001和0.062;c.1311单点突变的Hap2占比最多,为68.2%(30/44),高频率突变位点c.1311的等位组成亦最复杂,出现非突变半合(9/44,20.4%)、突变半合(16/44,36.4%)、非突变纯合(5/44,11.5%)、突变杂合(10/44,22.7%)、突变纯合(4/44,9.1%)等5种合子。c.1311位点突变与伯氨喹性溶血发生的OR值为0.6879(P>0.05),未显示关联性。Tjima’s中性检验D值为-1.414(P>0.05),且全段的D值均<1,表明研究序列检出的突变不属于定向选择压力下的非中性突变,Ka/Ks比值为0.062,说明研究序列非常保守、错义突变率低于同义突变率。结论云南省间日疟患者中,常见的G6PD基因编码区突变为c.1311位点的T>C碱基替换,但仅c.1376位点的G>T突变与氧化剂突变诱发性溶血的发生呈正相关性。     

中缅边境恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1,2基因多态性研究

目的对云南省及边境地区恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白(merozoite surface protein,MSP)1,2基因进行分型研究,确定其等位基因的类型和分布特征,结合当地的恶性疟原虫株流行病学信息,为该地区疟疾的防治提供科学依据。方法从缅甸拉咱、那威和我国云南省西双版纳勐腊、德宏瑞丽、保山腾冲采集恶性疟患者血样。用巢式PCR(nest-PCR)扩增18S rRNA基因,确定感染疟原虫的种类。对检测为恶性疟原虫以及恶性疟原虫/间日疟原虫混合感染的样本,进行恶性疟原虫MSP-1、MSP-2基因的扩增并作测序、验证与序列分析。结果共采集89份恶性疟样本,经18S rRNA基因检测,确定间日疟9例,恶性疟78例和混合感染2例。在检测为恶性疟和混合感染的80份样本中,69例扩增出MSP-1基因片段,77例扩增出MSP-2基因片段。在MSP-1等位基因中,以MAD20型68.75%为主,RO33型23.75%和K1型20.00%次之。来源于勐腊的样本均未检出RO33型和K1型;MSP-2等位基因FC27型和3D7型的感染率均为91.25%,无明显的优势虫株;MSP-1和MSP-2基因多克隆样本所占百分比与多重性感染(multiplicity of infection,MOI)分别为22.50%、1.81和86.25%、3.51。MSP-1和MSP-2等位基因目的片段多样性与其原虫密度之间存在相关性(Spearman's r=0.496,P0.05;Spearman's r=0.240,P0.05)。MSP-1和MSP-2等位基因测序结果表明,在FC27型基因序列3′端发现1个新的APK序列,在3D7基因型序列中检测到1个新的PAT重复序列和其它19个新的序列。结论云南省及边境地区恶性疟原虫分离株MSP-1等位基因存在MAD20型、K1型和RO33型3种类型,以MAD20型为优势虫株,勐腊样本未发现K1型和RO33型;MSP-2等位基因存在FC27型和3D7型2种类型,其优势均不明显。     

云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白基因多态和种群结构分析

目的分析云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白(Pvcsp)基因序列,揭示当地Pvcsp基因的种群结构和遗传多样性。方法收集中国疾病预防控制中心传染病网络直报系统中2014-2017年报告的云南省本地和输入性间日疟病例流行病学资料及血样。提取血样中疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增并测序。采用MEGA 5.04、Arlequin 3.5.2.2软件进行单倍型、期望杂合度(He)分析,DnaSP 5.10计算核苷酸多样性(TT)、同义置换率(Ks)、错义置换率(Ka)及群体间遗传分化指数(Fst)。结果共检测间日疟病例血样969份,扩增获得650~750 bp大小的目的条带759份,包括云南本地感染者血样39份、非洲16份、缅甸688份、老挝13份、柬埔寨2份、巴基斯坦1份。单倍型分析结果显示,759条Pvcsp基因序列存在90个单倍型,其中29个为PV-I型温带族(类似VK210型),50个为PV-Ⅰ型热带族(类似VK210型),11个为PV-Ⅱ型(类似VK247型);3种基因型所占比例分别为51.4%(390/759)、41.1%(312/759)、7.5%(57/759),分布于云南本地感染、缅甸输入性病例中,但非洲、老挝及其他地区的输入性病例只表现为PV-Ⅰ型。PV-Ⅰ型、PV-Ⅱ型氨基酸序列突变分别发生在29、10个位点。759份病例血样的He为0.224,π为0.075,Ka/Ks为0.48。除去柬埔寨和巴基斯坦,Pvcsp基因在老挝输入性病例中的遗传多样性最高(He=0.422,π=0.03),云南本地与非洲输入性病例中的遗传分化最高(Fst=0.082),与缅甸输入性病例的遗传分化最低(Fst=0.002);Pvcsp基因在非洲与东南亚地区输入病例中属中等程度的遗传分化,在东南亚地区输入病例中遗传分化很小。结论云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白基因存在3种基因型,以PV-Ⅰ型温带族为优势虫株,不同基因型的种群结构和遗传分化不同。     

用微卫星分析我国不同地区间日疟原虫的种群结构

目的 了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫种群结构和遗传多样性特征,积累我国间日疟原虫遗传相关数据.方法 收集云南、海南、河南流行区间日疟患者血样,血涂片鉴定间日疟原虫阳性者抽提血液基因组,采用巢式/半巢氏PCR方法扩增特异性2.21微卫星片段,对扩增阳性产物进行基因扫描检测,根据检测微卫星的重复序列进行STR分型,并应用GENALEX软件计算等位基因频率、等位基因数目以及期望杂合度(expected heterozygosity,He).结果 间日疟原虫2.21微卫星在不同地区间日疟原虫样本中呈现高度的多态性,其等位基因数目变化范围为4～9,期望杂合度为0.613～0.853,比较不同地区,云南地区间日疟原虫等位基因数目为9,期望杂合度为0.853,变异度最高.结论我国不同地区间日疟原虫基因组具有较高的遗传多样性,其种群结构具有地区特征,这可能与各种群传疟媒介种类不同及地理环境差异等相关.     

云南省抗疟疾药物质量监测分析

目的了解云南省抗疟疾药物的质量情况，为抗疟疾药的使用和管理决策提供依据。方法在勐腊县和瑞丽市2个监测点，用德国微型实验室检测技术（GPHF）对样品初筛，进行物理检测、样品裂解及薄层层析（TLC）；将初筛过的样品（按送检比例）送国家药物质量控制实验室进行确认实验，内容包括视觉检查、活性成分检测等。结果2个监测点收集到6种抗疟疾药共128个样品，其中勐腊59个，瑞丽69个。在初筛过程中检测出4个可疑样品和3个不合格样品。合格率为94．5％、可疑率为3．1％，不合格率为2．3％。30个样品送往食品药品监督局进行确认实验，其中的7个样品没有通过确认实验，确认实验合格率为76．7％。结论云南部分抗疟疾药物存在质量不合格现象。需要对云南省抗疟疾药物质量持续监测。     

老挝占巴塞省按蚊种类及其疟原虫子孢子感染情况调查

目的对老挝占巴塞省按蚊种类及其疟原虫子孢子感染情况进行调查,为当地疟疾防治措施的制定与评估提供参考。方法2017年7月在老挝占巴塞省巴通坡县采用诱蚊灯通宵诱蚊法和通宵人诱法进行捕蚊,对捕获的成蚊进行形态学鉴定,取部分雌性按蚊提取基因组DNA,巢式PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的18S rRNA基因,计算按蚊疟原虫子孢子阳性率。结果共捕获蚊虫34 687只,分属库蚊、按蚊和伊蚊等8个属的29个种。库蚊属为当地优势属,占捕获蚊虫总数的92.6%(32 110/34 687);其次是按蚊属,占5.6%(1 947/34 687)。迷糊按蚊是按蚊属的优势种,占该属的65.5%(1 275/1 947);其后是可赫按蚊,占12.1%(235/1 947);菲律宾按蚊,占11.9%(232/1 947);中华按蚊,占5.1%(100/1 947)。巢式PCR共检测按蚊336只(可赫按蚊234只、中华按蚊100只和大劣按蚊2只), 8只按蚊间日疟原虫子孢子阳性,阳性率为2.4%(8/336)。其中,可赫按蚊子孢子阳性6只,阳性率为2.6%(6/234);中华按蚊子孢子阳性2只,阳性率为2.0%(2/100);均未检测到恶性疟原虫子孢子。巢式PCR扩增片段长120 bp,其序列与间日疟原虫序列(GenBank登录号为:KT991325、 KT991317、 MG708221、 MF540772、 LT635613、 KU569498、 AF145335、 KT991314和KX007932)的同源性为99%～100%。结论老挝占巴塞省捕获的可赫按蚊和中华按蚊存在间日疟原虫子孢子自然感染,且阳性率均较高。     

云南微小按蚊饲养观察及其人工感染间日疟原虫初步观察

为了建立实验室云南微小按蚊饲养品系,以观察该蚊生长发育情况及其人工感染间日疟原虫的敏感性,采用常规人工方法饲养微小按蚊和直接叮咬吸血法进行人工感染间日疟原虫观察.实验表明微小按蚊在室温26～28℃、相对湿度60%～75%、水温23～25℃,每日光照12 h的实验室条件下,其孵化率、化蛹率、羽化率分别为83.1%、78.2%、92.6%,并观察10批次微小按蚊,他们间的孵化率、化蛹率及羽化率无统计学差异;人工感染6例间日疟患者中,3例感染者微小按蚊蚊胃卵囊阳性,它们的卵囊感染率分别为61.6%、87.5%和100.0%.结果表明云南微小按蚊饲养条件在26～28℃、相对湿度60%～75%、水温23～25℃下生长发育较好,同时,该蚊对间日疟原虫仍然敏感.     

云南省2014年消除疟疾督导考核结果分析

目的 为了解2014年云南省消除疟疾指标和工作执行情况,发现和解决消除疟疾工作中存在的问题,进一步推进全省消除疟疾进程.方法 选取云南省玉溪市等10个州(市)并随机抽取所辖1个县(区),参照《云南省消除疟疾考核评估实施细则(2013年版)》开展考核.结果 发病率持续下降,发病率从2010年的4.63/10万下降至2014年的0.95/10万;10州(市)考核平均得分为92.7,最高玉溪市96.8,最低怒江州87.2,其他8州(市)分别为保山市96.6、德宏州94.2、红河州94.0、楚雄州93.4、版纳州92.2、文山州91.4、昆明市和临沧市各90.5;临床医生考试96人,及格86人,合格率89.6％,平均分73.1,最低平均分56,最高平均分83.2;检验人员疟原虫镜检考核40人,合格38人,合格率95％.结论 2014年消除疟疾工作项措施按要求实施,年度主要指标达到要求,疟疾发病率持续下降,效果显著,有力推进了全省消除疟疾进展.     

双氢青蒿素哌喹片治疗云南省恶性疟的临床观察

目的观察双氢青蒿素哌喹片对云南省恶性疟的疗效和安全性。方法在云南边境抗药性恶性疟流行区选择恶性疟患者69例,用双氢青蒿素哌喹片2d 4次疗法治疗并追踪观察28d。结果治愈率为100%,平均退热时间(34.99±16.51)h;平均无性体原虫转阴时间(33.14±11.91)h;配子体转阴率为95.46%,临床及实验室检查均未见明显不良反应。结论双氢青蒿素哌喹片2d 4次疗法治疗云南恶性疟具有高效、速效、低毒、疗程短、服药依从性高、配子体转阴率高等优点。     

云南省临沧市小管福寿螺COⅠ基因多态性分析

目的 通过对云南省临沧市小管福寿螺（Pomacea canaliculata）COⅠ基因的遗传标记分析,了解当地小管福寿螺基因多态性,为云南省后续开展广州管圆线虫病监测提供科学依据。方法 对采自云南省临沧市孟定镇38份小管福寿螺样本进行COⅠ基因扩增,并将PCR产物测序。运用MEGA 6.06软件Kimura?2参数模型,对来自于GenBank的福寿螺单倍型与本研究获得单倍型一起进行系统进化树构建和个体间遗传距离计算,分析其遗传多样性。结果 共获得31条序列,分属3种单倍型（Haplotype1~Haplotype3）,其中Haplotype1的频率较高,占整个样本的83.9%（26/31）。3种单倍型与小管福寿螺的遗传距离最小,为0 ~ 0.052;而与Pila conica的遗传距离最大,为0.021 ~ 0.239。进一步进化分析表明,3种单倍型均为小管福寿螺,与来自日本熊本（GenBank登录号：AB 433769）、中国香港（GenBank登录号：KT 313034）和美国夏威夷（GenBank登录号：EU 523129）的小管福寿螺序列聚成一大支,具有较近的亲缘关系;而与P. insularum（GenBank登录号：EF 514942）、P. camena（GenBank登录号：EF 515059）等序列的亲缘关系较远。结论 云南省临沧市存在小管福寿螺,本研究获得的3种单倍型之间存在较大的遗传分化。