2型猪链球菌cps2D基因敲除株的构建及其基本生物学特性的研究北大核心CSCD

目的构建2型猪链球菌荚膜多糖基因簇中cps2D基因敲除株(Δcps2D),比较野毒株05ZYH33与敲除株Δcps2D基本生物学特性的差异。方法设计合成引物L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2,分别扩增cps2D基因上、下游同源臂L片段、R片段及Spc^(R)抗性基因S片段,将3个片段连接至pUC19线性载体上,构建敲除质粒pUC19::cps2D。将敲除质粒电转导入05ZYH33感受态细胞后,利用Spc^(R)抗性平板筛选敲除株,并通过组合PCR和RT-PCR进一步验证。比较野毒株05ZYH33和敲除株Δcps2D细菌生长特性、溶血活性、革兰染色、细菌链长、荚膜形态等方面的异同。结果L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2三组引物分别扩增出L(1030 bp)、R(1030 bp)以及S(1130 bp)基因片段;通过无缝克隆的方法成功构建出敲除质粒pUC19::cps2D;电转入感受态细胞后获得69个克隆,筛选出26个疑似敲除株;组合PCR以及RT-PCR筛选后获得cps2D基因敲除株Δcps2D;与野毒株05ZYH33相比,Δcps2D对数期生长变缓,链长显著变短,荚膜稀疏变薄。结论成功构建cps2D基因敲除株,为后续进一步研究其调控荚膜合成的作用机制奠定基础。     

2型猪链球菌二元信号系统孤儿调控因子CovR磷酸化位点鉴定

目的 利用Escherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用。方法 构建CovR蛋白表达载体pCDFDuet-1::covR及pCDFDuet-1::covR/stk,重组表达蛋白分别命名为CovR1与CovR2。通过蛋白磷酸化质谱技术检验CovR2蛋白的关键磷酸化位点。分别构建CovR苏氨酸突变体CovRT、丝氨酸突变体CovRS、酪氨酸突变体CovRY及丝/苏/酪氨酸全突变体CovRA,与STK共表达后分析其磷酸化状态,确定CovR磷酸化靶点。结果 在E. coli BL21表达系统中成功表达并纯化CovR1与CovR2蛋白,Western blot分析发现CovR1无磷酸化信号,CovR2可以被磷酸化。进一步对CovR2磷酸化质谱检测发现其第45、148、150、159、168、194、219位苏氨酸,第40、172、215位丝氨酸以及第225位酪氨酸为关键磷酸化位点。对CovRT、CovRS、CovRY及CovRA突变体磷酸化状态检测,结果表明CovR2的丝/苏/酪氨酸均可发生磷酸化。结论 在E. coli BL21中共表达STK与CovR可导致CovR丝/苏/酪氨酸磷酸化,通过质谱技术鉴定了CovR的磷酸化位点,提示CovR可能是STK的磷酸化调控靶点。     

2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建北大核心CSCD

目的构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C。将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株。qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平。结果重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH I和EcoR I酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2::P0530cps2C;将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 205ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功。提取野生株05ZYH33和cps2C过表达株总RNA后进行qRT-PCR实验,结果显示过表达株cps2C基因的相对表达水平较05ZYH33株上调2.4倍。结论本研究选用S.suis 205ZYH33的延伸因子TufA强启动子P0530作为启动子,成功构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C并导入S.suis 2感受态细胞,成功获得cps2C过表达株,为进一步研究酪氨酸激酶Cps2C功能提供实验材料。