云南省猪戊型肝炎病毒全基因组扩增及进化分析

目的 对猪戊型肝炎病毒全长基因组进行扩增,分析其进化关系,为HEV的感染性克隆研究奠定基础。方法 利用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR)和RACE技术对猪粪便中HEV样品进行全基因组扩增,利用DNAStar和MEGA4.0软件进行同源性比较和进化树分析。结果 RT-nPCR方法扩增出HEV的 5段目的基因序列和RACE技术扩增出HEV的 5'和3'端,序列比对结果正确,HEV全长扩增成功。同源性分析显示其与新疆株(GU119961)同源性较高(96.1%)。系统进化树显示该病毒属于基因4型h亚型猪HEV。结论 HEV全基因组序列扩增成功,为深入研究HEV奠定基础。     

产气肠杆菌组成型启动子的筛选及其活性测定

目的：从产气肠杆菌基因组中筛选组成型启动子,并检测其活性。方法用Sau3 AⅠ限制性内切酶将产气杆菌的基因组酶切到500 bp大小,连接到pCMR8 a载体上,转化DH5α感受态后涂布氯霉素和卡那抗生素的双抗平板上筛选启动子,经SDS－PAGE分析启动子的蛋白表达能力,筛选较强启动子并对其进行截短和顺反性实验,最后利用截短启动子表达不同的蛋白。结果成功筛选到了5个启动子序列,获得到了表达能力最强启动子的截短核心序列,验证了其具有反向启动外源蛋白表达的能力,成功表达了其他外源蛋白。结论本实验通过大肠埃希菌表达系统成功的筛选并验证了产气杆菌的一种组成型启动子,具有较强的启动外源蛋白表达能力,对工业上蛋白的生产及实验室表达某种蛋白具有重要意义。     

幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒的构建及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌hpaA基因,并构建其真核表达质粒。方法　以HpNCTC11637基因组DNA为模板, PCR扩增hpaA基因,亚克隆至pMD18 T载体中,目的基因经酶切纯化后插入pTCAE,转化E.coliDH5α,酶切并测序鉴定正 确的重组质粒命名为pT hpaA。电穿孔法将pT hpaA转染CHO细胞,Westernblot检测HpaA蛋白的表达。结果　克隆重组 得到pT hpaA,将pT hpaA电穿孔法转染CHO后,培养上清经Westernblot检测,在相对分子量为30000条带处出现特异性抗 原抗体反应。结论　成功构建了幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒,体外CHO细胞转染和Westernblot实验证实了HpaA蛋 白的表达,为进一步的免疫实验奠定了基础。     

微载体培养MEK和Vero细胞试制甲肝灭活疫苗

目的探索微载体培养细胞大量制备甲肝病毒抗原及其灭活疫苗的可行性。方法使用 Cytodex- 1培养恒河猴胚肾细胞和 Vero细胞制备 HAV ,经过初步纯化、甲醛灭活、吸附佐剂 ,制成甲肝灭活疫苗 ,免疫昆明种小白鼠 ,测定免疫原性。结果 HAV X株和 W株抗原滴度分别为 1∶ 2 5 6、1∶ 12 8,感染滴度 (log TCID5 0 / m l)分别为 8.5 0、8.17,与静止培养获得的滴度相当。小鼠抗 HAV抗体第 45 d达到峰值 ,滴度分别为 1∶ (96 .0± 78.4)、1∶ (12 8.0± 70 .1)。结论实验性甲肝灭活疫苗具有良好的免疫原性 ,应用微载体培养细胞制备甲肝灭活疫苗是可行的。     

人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus, HAstV）非结构蛋白nsP1a／1,免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白,使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS?PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的nsP1a／1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清,用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1?pET28a原核表达载体构建成功,将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白,免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1,为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。     

复制器：促进病毒在感染细胞内复制的一种“细胞器”

某些正链RNA病毒感染细胞之后,重塑了宿主的细胞内膜,使内膜环境发生改变,形成了专门促进病毒复制的细胞器称为复制器。它是由病毒的非结构蛋白招募特定的细胞蛋白在细胞内膜上形成病毒复制复合物,并在复制器的膜表面作为复制结合位点进行病毒的复制、组装等。文章主要从复制器的结构,病毒复制过程中的功能及其作用机制进行讲述,为进一步研究病毒感染机制提供了参考。     

结核复合抗原疫苗不同抗原组合对小鼠免疫功能的影响

Objective To study the immune function of mice immunized by different combinations of antigen 85b ( Ag85b), fusion protein culture filtered protein 10 ( CFP-10), early secreted antigenic target 6 kDa protein (ESAT-6) and heat shock protein X (Hsp X) with combined adjuvants of Bacille CalmetteGuerin (BCG) CpG and aluminum.Methods According to antigen combinations, 48 BALB/c mice were divided into 8 groups: ( 1 ) group A: Ag85b + CFP-10/ESAT-6 + HspX + adjuvant; (2) group B: CFP-10/ESAT-6 + HspX + adjuvant; ( 3 ) group C: Ag85b + HspX + adjuvant; (4) group D: Ag85b + CFP-10/ESAT-6 + adjuvant; (5) group E: Ag85b + adjuvant; (6) group F: CFP-10/ESAT-6 +adjuvant; (7)group G: HspX + adjuvants; (8) control group: saline (6 mice per group).The mice were subcutaneously immunized 3 times.One week after the third subcutaneous immunization, spleens were collected for enzymelinked immunospot (ELISPOT) assay to detect IFN-γ and IL-4 secretion, and for the lymphocyte proliferation assay to observe antigen-specific lymphocyte proliferation.Serum samples were separated for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the titers of antigen-specific IgG, IgG1 and IgG2a antibodies.Results The amount of IFN-γ spots in Group E [median ( quartile), 122.8 (78.4 - 184.4 )]was significantly more than that in group C [14.3 (6.5 - 14.6)] and the control group [0.5 (0.5 - 1.3)](u =0.0, P ＜ 0.01 ).The amount of IL-4 spots in Group D stimulated with Ag85b and CFP-10/ESAT-6 [173.5 (78.8 -233.4), 132.8 ( 50.3 - 159.4)] were significantly more than those in the control group [0.5 (0.5 - 1.3 ), 5.3 ( 2.9 - 6.5 )] ( u = 0.0, P ＜ 0.01 ).The level of stimulation index of lymphocyte proliferation in Group A, C, D, E(2.42 ±0.50, 2.18 ±0.37, 2.86 ±0.51, 2.70 ±0.15) was significantly higher than that of the control group ( 1.11 ± 0.13 ) ( F= 20.96, P ＜ 0.01 ).The level of antigen-specific IgG, IgG1 , IgG2a antibody titers induced by Hsp X [lg( antibody dilution degree), 3.90 -5.21] was significantly higher than those induced by Ag85b (3.30-4.51 ) and CFP-10/ESAT-6 (3.10 -4.05) ( F = 63.8 - 70.4, P ＜ 0.01 ) .Conclusions With the use of adjuvants, different antigen combinations showed different influences on the immune function in mice.A combination of 3 antigens did not elicit the best immune effect, suggesting that the interaction among antigens may affect their immunity.     

甲型肝炎病毒的分子生物学研究进展

本文对甲型肝炎病毒(HAV)的基因组结构与功能、细胞适应及其减毒的分子机制、体外培养时致细胞病变的机制以及HAV的细胞受体作了综述。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白，获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10，插入到同样双酶切的表达载体pET32a，构建重组载体IL-10／pET32a，测序正确后转化E.coli BL21（DE3），不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白，SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达，ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确，诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx，同时也存在包含体融合蛋白，经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10，MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx，有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。