猪源戊型肝炎病毒上海株全基因组序列分析

目的分析猪源戊型肝炎病毒(HEV)上海株swChinash与已知其它HEV基因型的差异和人源HEV的关系。方法设计22对PCR引物,分片段进行扩增,两末端采用快速扩增方法(RACE)扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序,用DNASTAR软件与53株人源和猪源HEV的基因组进行同源性分析,用Clustalx和Mega3.0软件绘制基因进化树。结果swChinash全序列除去poly(A)尾,由7235个核苷酸组成,ORF1～3分别编码1707,660,122个氨基酸。全基因序列与Ⅳ型的核苷酸同源性为83.4%～84.7%,与其他三型为73.3%～76.3%,其中与中国人源长春株最高,为84.7%。结论基于ORF1～3和全长基因组的进化树,猪源HEV上海株swChinash属于基因Ⅳ型,与其他Ⅳ型HEV亲缘关系较远,单独在一个进化分支上。     

猪戊型肝炎病毒IgG抗体检测和部分核酸序列分析

目的 了解猪戊型肝炎病毒(HEV)感染情况,探讨猪HEV基因型与人HEV的关系。方法用酶联免疫吸附法(ELISA)和逆转录巢式聚合酶链反应法(RT-nPCR)分别检测猪血清抗-HEV IgG抗体和猪HEV RNA,并用Vector NTI Suite 7和TreeView软件进行人与猪HEV核酸序列和基因进化树分析。结果 猪抗-HEV抗体阳性率为16.67%(18/108),并从18份抗-HEV IgG阳性的猪血清中扩增到2株(11.11%,分别命名为S18和S43)HEV 开放读码框(ORF)1片段(102～387bp),两者核苷酸序列同源性为99%,与HEV基因型1～8的核苷酸序列同源性分别为76%～77%、78%、76%～79%、85%～86%、77%、80%、79%和75%～79%。其中1株(S18)还扩增出HEV ORF2片段(5994～6297bp),与HEV基因型1～4的核苷酸序列同源性分别为76%～78%、74%、74%～77%、85%～94%。结论 分离的2株猪HEV属于HEV基因型4。     

云南某农村猪戊型肝炎病毒分子流行病学调查

目的 了解云南农村散养猪群HEV感染情况,为HEV防控提供理论依据。方法 利用反转录套式聚合酶链反应（RT-nested PCR）技术,对所采集云南猪群78份粪便样品进行HEV ORF2基因部分片段扩增,经琼脂糖凝胶电泳后对目的条带进行回收纯化及克隆测序。序列利用DNAStar和MEGA4.0软件进行同源性比较和系统进化树构建。结果 RT-nested PCR方法扩增出了350bp目的基因序列,该序列与GenBank中HEV各型的同源性在77.4~97.4%之间,与基因4型同源性最高（97.4%）,与3型同源性最低（77.4%）。系统进化树显示测定的序列与基因4型聚为一支,表明该序列属于基因4型。本次实验共检测了78份猪粪便样品,其中8份为阳性,阳性率为10.26%。结论 云南农村人群存在感染HEV的风险,应该加以防控以免HEV暴发流行。     

一种全长扩增克隆HEV方法和HEV体外瞬时转染体系的建立

目的建立HEV全长基因组扩增克隆和全长HEV RNA体外瞬时转染细胞方法和初步应用。方法取5例抗HEV IgG阳性患者血清,采用特异性引物逆转录HEV RNA为cDNA,设计通用的分段且相互重叠的PCR引物分步扩增,然后再分别将PCR产物进行重组PCR扩增,最终获得全长的HEV RNA cDNA产物片段。测序确定其序列,采用T-A克隆全长HEV cDNA序列,将HEV全长cDNA序列进行体外转录,提取转录后产物的RNA(去除DNA模板),获得高水平的HEV RNA产物,采用脉冲电流转染HepG2细胞,转染后24 h、48 h和96 h观察细胞上清HEV抗原分泌和HEV RNA载量。结果自Gen Bank获得约300条HEV全长基因组序列,设计了分段重组PCR方法,快速获得了HEV基因组全长序列;T-A克隆HEV全长基因组测序分析其序列,体外转录制备高纯度的HEV mRNA,通过电转方式转入HepG2细胞,在较短时间内检测出HEV RNA,有效地评价了HEV的体外表型。HEV抗原要先于HEV RNA出现;体外实验显示Ⅰ型和Ⅳ型HEV复制能力无明显差别,都在转染后48 h达到峰值。结论建立的分段重组PCR法扩增HEV全长基因组,体外电转细胞系后分泌HEV RNA,为后续HEV分子病毒学和表型耐药研究提供了条件。     

华支睾吸虫HMGB1同源分子的识别及其进化研究北大核心CSCD

目的识别华支睾吸虫HMGB1同源分子的CDS及其蛋白序列,并分析其进化特征。方法分别用基于麝猫后睾吸虫HMGB1预测序列的5'和3'RACE以及基于华支睾吸虫HMGB1基因组预测序列的PCR法扩增华支睾吸虫成虫来源的cDNA,对扩增产物进行克隆测序,并进行序列的同源性比较和拼接,分析其ORFs,据此对华支睾吸虫成虫来源的cDNA进行PCR扩增验证其转录;构建进化树,对识别出的HMGB1同源分子进行进化分析。结果识别出两个华支睾吸虫HMGB1同源蛋白CDS,大小分别为381和477 bp,二者均在华支睾吸虫成虫转录,产物均一;推测其编码蛋白分别为127和159个氨基酸,其分子序列与血吸虫同源性较高,而与人及其他脊椎动物同源性低。结论成功识别出华支睾吸虫HMGB1同源蛋白CDS序列,为研究其与肝胆管癌发生的关联性和机制奠定了基础。     

长春地区人与猪戊型肝炎病毒分子流行病学及部分基因序列分析

目的分析长春地区猪和人群流行的戊型肝炎病毒的系统进化关系。方法参照文献设计引物,对长春地区猪和人群流行的8株HEV(其中3株来源于人,5株来源于猪)进行RT-PCR,并将RT-PCR产物克隆到p MD18-T载体,筛选阳性重组质粒测序,测序结果采用Clustal X v.1.8进行多重比对分析,并与基因1~4型HEV代表株的核苷酸及氨基酸进行同源性比较,绘制遗传进化树。结果本研究获得的8株HEV核苷酸同源性在91.2%~99.1%,推导氨基酸同源性在97.4%~100%之间;基因1~4型内各株序列间同源性分别为:87.9%~100%,100%,85.9%~96.6%,84.8%~100%。结论研究表明获得的长春各株病毒均属基因4型,由进化关系看长春地区猪HEV与人HEV可能由同一毒株进化而来。     

我国戊型肝炎的研究进展

一、病原学 1.1 中国戊型肝炎病毒(HEV)流行株cD-NA全序列的测定和分析 1992年北京医科大学与日本大学医学院合作,对我国新疆一株流行性HEV cDNA全序列进行了测定和分析。该HEV株是从1986～1988年新疆南部地区戊型肝炎(HE)流行时一名女性患者粪便中分离,然后实验感染猕猴,再从猕猴的胆汁中提取HEV RNA,经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后,用双脱氧核苷酸DNA链末端终止直接测序法测定,与缅甸株HEV(B)核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.9％和98.8％,低于缅甸各HEV株间的同源性(分别为98.5％和99.2％)。核苷酸     

副粘病毒Tianjin株基因组3''和5''末端序列测定及分析

目的 测定副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端序列,分析其前导区一级及二级结构与功能的关系. 方法 从感染病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增(RACE)法分别扩增基因组3'和5'端cDNA片段,并克隆至pGM-T载体中,然后分别测定插入片段的核苷酸序列,用DNAStar软件将测得的3'和5'端前导区序列与GenBank中选取的6株仙台病毒代表株相应序列进行相似性比较及序列比对,用RNAdraw软件预测基因组3'和5'端前导区二级结构并进行比较分析. 结果 副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'末端非编码区长度分别为119和142个核苷酸,前导区核苷酸序列与6株仙台病毒基因组的相似性分别在89.1%～96.4%和93.0%～96.5%,二级结构与选取的已知仙台病毒株高度相似而且稳定. 结论 副粘病毒Tianjin株基因组3'和5'端前导区序列相对保守,可能与病毒复制、转录调控及致病性有关.     

1株鼠源狂犬病毒野毒株全基因组序列测定与分析

目的对1株分离自牛狂犬病疫区野鼠脑内的狂犬病毒野毒株(MRV)进行全基因组测序,并对其分子变异和进化特点进行分析。方法RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3′末端和5′末端采取3′-RACE和5′-RACE方法。结果9个重叠基因片段序列拼接得到MRV全基因组序列,共11869个核苷酸。MRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异。选择有代表性的狂犬病毒株,构建了N基因分子系统进化树。结论MRV毒株属于狂犬病毒基因1型,与AV01和CVS同源性最高为99%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为72%。     

2006-2008年安庆地区散发性戊型肝炎病毒血症检测与序列分析

目的了解安庆地区散发性戊型肝炎病毒血症的检出率与基因型的分布。方法收集2006-2008年间安庆市立医院血清戊肝IgM抗体阳性患者的血清(包括单份血清和系列血清)共145份,采用巢式RT-PCR方法检测HEVRNA,并扩增494-nt核苷酸片段,进行基因分型和同源性比对。结果在57名血清戊肝IgM抗体阳性的患者血清中,HEVRNA总检出率为47.37%;男性与女性分别为50.00%、40.00%,两者间无显著性差别(χ2=0.44,P=0.51)。其中,单份/首份血清的检出率最高(26/57,45.61%),第2份血清较低(8/35,22.86%),第3份及以后的血清几乎未检出阳性(1/53,1.89%)。所有35条HEV核苷酸序列均为基因Ⅳ型,与2007-2008年间获得的27株安庆地区猪基因Ⅳ型HEV共同比对后发现,人序列之间、猪序列之间、人与猪序列之间的同源性都约为86%;不同年份、不同宿主(人与猪)的HEV核苷酸序列间的同源性均在84%～88%之间。结论基因Ⅳ型HEV是安庆地区散发型戊肝的主要病毒株。当地人与猪HEV序列的同源性较高,提示HEV在人与猪之间存在相互传播的可能。     

Acute hepatitis due to hepatitis E virus genotype 1 as an imported infectious disease in Japan

An 18-year-old Nepalese man was admitted due to general malaise and anorexia a month after coming to Japan. Laboratory tests showed elevation of transaminase and positivity for IgM anti-HEV antibody. Serum HEV RNA was detected by RT-PCR amplifications. An HEV genome phylogenetic tree, constructed using an 821-nucleotide sequence in the open reading frame 1, indicated that the genotype was 1. HEV genotype 1 is epidemic in South Asia, Africa and South America, and the incidence of acute hepatitis due to HEV genotype 1 is low in Japan. Thereafter, attention should be paid to HEV genotype 1 infection as an imported infectious disease.     

Seroepidemiology and genetic characterization of hepatitis E virus in western Yunnan Province

Objective:To investigate the seroepidemiology and genetic characterization of hepatitis E virus(HEV) in western Yunnan Province.Methods:Questionnaire survey was conducted among1638 residents in western Yunnan Province using stratified sampling method.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect serum anti-HEV IgG and IgM.HEV RNA was extracted from patients with serum anti-HEV IgM positive.The open reading flame 2(ORF2) of HEV that was amplified by nested RT-PCR was sequenced and compared with standard HEV genotypes 1-4.Results:Serum anti-HEV positive was found in 13.929(228/1638) residents.The HEV infection rate in males was significantly higher than that in females with a ratio of 1.47(P0.01).20-30 and30-40 years old young men showed the highest incidence.20.57%and 20.78%.respectively.While10-20 and 20-30 years old young women exhibited the highest infection rate,11.85%and 15.60%,respectively.According to occupation,the highest HEV infection rate was observed in farmers(20.35%) and migrants(16.50%).We isolated 10 individual HEV isolates from 31 patients with serum anti-HEV IgM positive.Homology analysis and phylogenetic analysis indicated that these10 HEV isolates belonged to HEV genotype 4 with the homology of 78.65%-94.71%.Conclusions:The HEV infection rate is high in western Yunnan Province.HEV genotype 4 is the leading cause of HEV infection and young farmers and migrants are the main infected population.     

Identification of 5′ capped structure and 3′ terminal sequence of hepatitis E virus isolated from Morocco

AIM: To examine 5′ and 3′ terminal sequences of hepatitis E virus (HEV) isolated from Morocco, to confirm 5′ methylated cap structure of the genome, and to investigate whether the 3′ UTR can be used to distinguish HEV genotypes instead of HEV complete genome sequence.METHODS: RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends (RLM-RACE) was employed to obtain the 5′ and 3′ terminal sequences of HEV Morocco strain. The 3′ UTR sequence of the Morocco strain was compared with that of the other 29 HEV strains using the DNAStar software.RESULTS: The 5′ PCR product was obtained only from the RLM-RACE based on the capped RNA template. The 5′ UTR of the Morocco strain had 26 nucleotides, and the 3′ UTR had 65 nucleotides upstream to the polyA. The 5′ UTR between HEV strains had only point mutations of nucleotides.The phylogenetic tree based on the sequences of 3′ UTR was not the same as that based on the complete sequences.CONCLUSION: The genome of HEV Morocco strain was methylated cap structure. The 3′ terminal sequence can not be used for distinguishing HEV genotype for all HEV strains in place of the whole HEV genome sequence.