大鼠骨髓基质干细胞在成骨诱导剂条件下的成骨能力

目的:观察在有成骨诱导剂存在的条件下,大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。方法:实验于2005-07/12在锦州医学院中心实验室完成。选取清洁级2月龄SD大鼠6只,无菌条件下取双侧股骨,制备单细胞悬液。采用贴壁培养与传代结合方法分离纯化大鼠骨髓基质干细胞,将2代细胞置于含有1×10-7mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸成骨诱导剂的培养基中,培养21～30d。应用倒置显微镜观察骨髓基质干细胞与诱导后细胞形态,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并用碱性磷酸酶染色和VON-KOSSA法检测成骨能力。结果:6只大鼠均进入结果分析。①骨髓基质干细胞形态学观察结果:在成骨诱导剂里细胞增殖变缓慢,呈长梭形、成纤维细胞样或不规则形。②细胞生长曲线:1～2d为潜伏期,细胞增殖不明显;3d后细胞增殖明显加快,进入对数生长期;6d后增殖变慢为平台期。经计算细胞群体倍增时间为38h。③细胞增殖周期检测结果:G0/G1期为(82.12±4.60)%,S期为(14.35±2.32)%,G2/M期为(0.87±0.30)%。④成骨能力检测结果:细胞碱性磷酸酶染色阳性率为86%,VON-KOSSA染色提示有钙结节形成。结论:大鼠骨髓基质干细胞在有成骨诱导剂存在的情况下成骨能力较高。     

小鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化过程中调控PDX-1基因表达miRNAs的鉴定

目的实现小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)的诱导分化并对分化过程中可能调控胰十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)基因表达miRNAs进行鉴定。方法首先分离培养BMSCs,应用conophylline和尼克酰胺将其诱导分化为IPCs,采用双硫腙(DTZ)染色和免疫荧光检测胰岛素的表达。然后采用靶基因预测软件miRanda和Target Scan对调控PDX-1基因表达miRNAs进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测诱导分化过程中miRNAs及PDX-1的表达。结果诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色,免疫荧光化学显示有胰岛素表达。生物信息学方法预测得到4个可能调控PDX-1表达的miRNAs,通过双荧光素酶报告基因系统检测发现其中的miR-149和miR-346能结合到PDX-1 mRNA的3’UTR并有效抑制其表达。Real-time PCR检测结果表明,miR-149和miR-346的表达水平与PDX-1表达呈负相关。结论 miR-149和miR-346能负性调控IPCs诱导分化过程中PDX-1的表达。     

胶原-壳聚糖支架材料与间充质干细胞的组织相容性

背景：近年来一些研究发现胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料可作为神经组织工程的支架材料,但相关细胞相容性研究较少。目的：观察兔骨髓间充质干细胞在胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料表面生长及分化情况。方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,无血清培养液培养,流式细胞仪检查细胞表型;然后,将其接种到凝胶支架材料表面（实验组）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面（对照组）,神经诱导培养基内培养,倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果与结论：细胞表型为CD29＋、CD44＋、CD166＋。倒置相差显微镜观察：实验组中,接种的骨髓间充质干细胞生长良好,7d后可见有突起神经细胞,细胞生长情况与对照组未见有明显差别。证实胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料对骨髓间充质干细胞有良好细胞相容性。     

胶原蛋白-硫酸肝素神经生物支架材料的制备

摘要 背景：有报道胶原-氨基聚糖材料基体植入周围神经组织节段性损伤处,可以促进神经轴突修复再生。硫酸肝素是细胞外基质的重要组成部分。 目的：制备胶原蛋白-硫酸肝素神经组织工程生物支架,观察其生物相容性并用于神经损伤的修复。 方法：将胶原蛋白-硫酸肝素悬浊液冷冻干燥,通过显微物镜、扫描电镜观察内部孔隙结构,测量孔的大小。选取SD大鼠12只制备5 mm坐骨神经神经缺损模型,随机分为3组。硫酸肝素复合胶原支架移植桥接组、空白对照组(旷置)、正常对照组(自体神经移植)。移植术后经神经功能学观形态学检测其修复疗效。 结果与结论：胶原蛋白复合硫酸肝素支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构,高度仿生神经的内部空间三维结构。组织学染色、电镜观察证实再生神经纤维成功地长入组织工程材料内。部分大鼠运动功能恢复良好。结果提示,胶原蛋白复合硫酸肝素材料组织相容性良好,可以促进神经的再生并可用于神经损伤的修复。 关键词：胶原蛋白;硫酸肝素;神经干细胞;生物材料;神经组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.009     

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊内细胞浓度与胰岛素和C肽的释放**

摘要 背景：微囊化已经普遍应用于各种实验研究,微囊包裹的干细胞治疗糖尿病问题也成为当今的热点,但是囊内包裹的细胞浓度与胰岛素释放量的关系成为目前需要解决的问题之一。 目的：运用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹胰岛素产生细胞,观察细胞浓度对胰岛素和C肽释放情况的影响。 方法：制备大鼠胰腺损伤提取物,将小鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素产生细胞。免疫荧光和双硫腙染色鉴定诱导后细胞内胰岛素的表达。然后将胰岛素产生细胞制成浓度分别为1×107 L-1,5×107 L-1,1×108 L-1,5×108 L-1,1×109 L-1,5× 109 L-1的细胞悬液,气体吹喷法制成微囊,用6-羧基乙二酸荧光素检测囊内细胞活力,用葡萄糖刺激微囊内细胞检查其胰岛素和C肽的分泌情况。 结果与结论：胰腺损伤提取物诱导后双硫腙染色和细胞免疫荧光鉴定出胰岛素产生细胞内有胰岛素的表达;胰岛素产生细胞制成的微囊直径约为400 µm,大小均一,6-羧基乙二酸荧光素检测到囊内细胞的活力很好。用葡萄糖刺激不同细胞浓度的微囊,发现细胞浓度为1×108 L-1时,胰岛素和C肽的分泌达到最高。 关键词：微囊化;骨髓间充质干细胞;胰岛素产生细胞;胰岛素;C肽 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.046     

降低肾脏免疫组化染色背景着色的方法

传统的免疫组织化学染色从最初的PAP法发展到S-ABC法和SP法[1],特异性和灵敏度越来越高.最近几年发展的PV法又称为两步法使得免疫组化更加简单快速,背景更加清晰.但是有时还是因为染色背景过高而影响结果判定.本文介绍一种新的染色方法,在"两步法"基础上大大降低肾脏组化片的染色背景,从而提高结果判定的准确性.     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

胶原蛋白复合壳聚糖支架的制备及生物学性状:壳聚糖及胶原比例筛选

背景:壳聚糖和胶原类支架已成为组织工程常用的载体材料.但是,现阶段如何能够通过调节二者比例而达到理想的细胞载体仍是目前需要解决的问题之一.目的:调节胶原与壳聚糖二者配制比例制备支架材料,检测及对比不同比例支架材料生物学性质.方法:制备1:1,1:2,1:3,1:4,1:5比例的壳聚糖、Ⅰ型胶原蛋白成分,经紫外线交联后冷冻干燥,再将其用NAOH与蒸馏水进行中和,二次冻干制备好支架.观察不同比例支架的材料性质、孔隙率、降解率、溶胀率;扫描电镜观察孔径的大小及形态.结果与结论:在壳聚糖含量固定,支架的大体孔径经统计比较差异有显著性意义(P<0.05).1:3比例制备的孔径最大,达到(298.0+36.0)μm;支架总体的孔隙率为93.9%～97.5%,胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微.各组支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少.在支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢.结果证实,通过紫外光交联法,按照1:3配比的胶原和壳聚糖的支架材料更加适合软骨组织工程的要求.     

β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓基质细胞神经细胞蛋白的表达

目的:骨髓基质细胞具有向神经细胞分化的能力,观察化学诱导剂β-巯基乙醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞后神经细胞标志蛋白的表达率。方法:实验于2006-09-01/2006-10-20在辽宁医学院中心实验室完成。①实验材料:选取清洁级2月龄SD大鼠12只,由辽宁医学院实验动物中心提供,体质量200g左右,雌雄不拘。②实验方法:采用贴壁培养与传代的方法分离纯化SD大鼠骨髓基质细胞,将第2代细胞置于含有4mol/Lβ-巯基乙醇诱导剂的培养基中诱导6h。③实验评估:应用倒置显微镜观察骨髓基质细胞与诱导后细胞形态,采用免疫组织化学法检测巢蛋白,胶质纤维酸性蛋白,神经丝蛋白的表达率。结果:诱导前大鼠骨髓基质细胞以长梭形细胞为主,诱导后可见细胞体积缩小,胞体伸出较多突起并有分枝出现,个别细胞形态类似神经细胞。诱导6h后,细胞中巢蛋白、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白均有表达,表现为胞浆呈棕黄色,免疫组织化学检测神经细胞标志蛋白神巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白表达率分别为85.12%,6.56%,80.17%。结论:大鼠骨髓基质细胞体外分离纯化方法简单易行,在β-巯基乙醇诱导下,较高的表达了神经细胞标志物。     

HGF对肝癌SMMC-7721细胞株上皮—间叶转化蛋白表达的影响

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）对肝癌SMMC-7721细胞株细胞外上皮—间叶转化蛋白基质蛋白的影响及可能作用途径。方法分别用HGF和PI3激酶抑制物LY294002处理肝癌SMMC-7721细胞,流式细胞技术检测SMMC-7721细胞株N-cad、E-cad、MMP-2、MMP-9、Vimentin表达水平。结果与对照组比较,HGF组N-cad、MMP-2、MMP-9、Vimentin表达明显升高、E-cad表达明显降低。LY294002预处理后,MMP-2、MMP-9的表达较HGF处理组明显下降,E-cad表达升高,N-cad和Vimentin变化不明显。结论 HGF可促进SMMC-7721的上皮间叶转化,该作用可能通过PI3激酶途径实现。