微血管内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化及其移植的可行性

背景：骨髓间充质干细胞通过再生心肌细胞在心肌损伤性疾病治疗方面突显较大潜力,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。 目的：探讨微血管内皮细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的潜能,并分析其移植的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察及体内移植实验,于2008-07/2009-02在重庆市神经病学重点实验室完成。 材料：清洁级二三月龄健康雄性SD大鼠16只,购自重庆医科大学实验动物中心 方法：孔径0.4 µm的transwell小室,置入培养板孔构成双室培养体系。取SD大鼠1只,Ficoll密度梯度+贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,组织块法分离培养微血管内皮细胞。培养瓶中融合至50%生长良好的微血管内皮细胞,每3 d更换培养液,收集更换液过滤即制成条件培养液。体外实验分为4组：直接接触组、双室培养组、条件培养液组、培养液对照组,观察各种培养条件对骨髓间充质干细胞的心肌诱导效应。取SD大鼠15只建立心肌梗死模型,冠状动脉结扎后第6天任取1只大鼠明确心肌梗死建模是否成功,其余大鼠随机分为细胞移植组8只、模型对照组6只。造模1周后,细胞移植组将在双室模型中与微血管内皮细胞共培养5 d的骨髓间充质干细胞调整浓度为109 L-1,通过鼠尾静脉缓慢注入1 mL,模型对照组予等量DMEM,观察4周。 主要观察指标：体外实验通过免疫荧光染色检测心肌标志物TnI、α-actin的表达;采用心电图、荧光镜检、苏木精-伊红染色等方式评价体内移植的安全性及可行性。 结果：直接接触组、双室培养组、条件培养液组部分骨髓间充质干细胞心肌标志物TnI、α-actin阳性表达,荧光镜下胞浆发绿光(或红光),前2组诱导率基本相似(P > 0.05),且均明显高于条件培养液组(P < 0.05);培养液对照组细胞未向心肌样细胞分化。细胞移植后两组大鼠均存活良好,未出现死亡及恶性心律失常,4周后细胞移植组心脏冰冻切片荧光镜检显示心肌内有少量胞核蓝染的细胞,提示干细胞成功归巢,结合苏木精-伊红染色,归巢细胞位于心肌梗死灶周边区域,呈单个或小团聚集;而模型对照组心肌切片未见胞核蓝染的细胞。 结论：微血管内皮细胞能够通过旁分泌途径诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,经微血管内皮细胞预处理过的骨髓间充质干细胞移植入大鼠体内是安全的,可成功归巢到大鼠心肌梗死灶及周边区。     

微血管内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化及其移植的可行性

背景:骨髓间充质干细胞通过再生心肌细胞在心肌损伤性疾病治疗方面突显较大潜力,但目前仍未找到一种理想的诱导方式.目的:探讨微血管内皮细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的潜能,并分析其移植的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内移植实验,于2008-07/2009-02在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:清洁级二三月龄健康雄性SD大鼠16只,购自重庆医科大学实验动物中心方法:孔径0.4 μm的transwell小室,置入培养板孔构成双室培养体系.取SD大鼠1只,Ficoll密度梯度+贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,组织块法分离培养微血管内皮细胞.培养瓶中融合至50%生长良好的微血管内皮细胞,每3 d更换培养液,收集更换液过滤即制成条件培养液.体外实验分为4组:直接接触组、双室培养组、条件培养液组、培养液对照组,观察各种培养条件对骨髓间充质干细胞的心肌诱导效应.取SD大鼠15只建立心肌梗死模型,冠状动脉结扎后第6天任取1只大鼠明确心肌梗死建模是否成功,其余大鼠随机分为细胞移植组8只、模型对照组6只.造模1周后,细胞移植组将在双室模型中与微血管内皮细胞共培养5 d的骨髓间充质干细胞调整浓度为109L-1通过鼠尾静脉缓慢注入1 mL,模型对照组予等量DMEM,观察4周.主要观察指标:体外实验通过免疫荧光染色检测心肌标志物Tnl、α-actin的表达;采用心电图、荧光镜检、苏木精-伊红染色等方式评价体内移植的安全性及可行性.结果:直接接触组、双室培养组、条件培养液组部分骨髓间充质干细胞心肌标志物Tnl、α-actin阳性表达,荧光镜下胞浆发绿光(或红光),前2组诱导率基本相似(P>0.05),且均明显高于条件培养液组(P<0.05);培养液对照组细胞未向心肌样细胞分化.细胞移植后两组大鼠均存活良好,未出现死亡及恶性心律失常,4周后细胞移植组心脏冰冻切片荧光镜检显示心肌内有少量胞核蓝染的细胞,提示干细胞成功归巢,结合苏木精-伊红染色,归巢细胞位于心肌梗死灶周边区域,呈单个或小团聚集;而模型对照组心肌切片未见胞核蓝染的细胞.结论:微血管内皮细胞能够通过旁分泌途径诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,经微血管内皮细胞预处理过的骨髓间充质干细胞移植入大鼠体内是安全的,可成功归巢到大鼠心肌梗死灶及周边区.     

晚期胃癌患者外周血中TS和DPD mRNA的表达对替吉奥化疗疗效的影响

目的探讨外周血中胸苷酸合成酶(TS)和二氢嘧啶脱氢酶(DPD)mRNA对晚期胃癌患者接受替吉奥(S-1)治疗疗效的预测价值。方法 24例晚期胃癌患者均接受口服S-1化疗,采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测患者外周血中DPD mRNA和TS mRNA的表达,观察其表达与化疗疗效的关系。结果 TS mRNA低表达组的S-1化疗有效率为50%明显高于TS mRNA高表达组的25%(P<0.05),TS mRNA低表达组化疗后的平均生存时间为8.4个月,明显长于TS mRNA高表达组的3.5个月(P<0.05)。DPD mRNA低表达组的S-1化疗有效率为42%,与DPD mRNA高表达组的33%相似(P>0.05)。DPD mRNA低表达组的患者的总生存时间为6.5月,与DPD mRNA高表达组的7.2月相似(P>0.05)。结论外周血中TSmRNA高表达的患者对S-1治疗的有效率较低,生存时间较短,而DPD mRNA表达与S-1的疗效无显著相关性。     

甘露聚糖肽联合化疗对胃癌的疗效观察

目的:观察甘露聚糖肽序贯治疗与放化疗联合应用治疗胃癌的疗效。方法:102例Ⅳ期胃癌住院患者,男性62例,女性40例,平均58岁,随机分为试验组和对照组,各51例。两组给予常规治疗:多西紫杉醇+氟尿嘧啶+顺铂(DCF化疗),试验组加用甘露聚糖肽序贯治疗;对照组加用胸腺肽序贯治疗。观察指标:(1)生存质量:评价中位生存期和治疗结束后1年的生存质量评分。(2)免疫学指标:CD4、CD8、CD4/CD8、外周血白细胞、抗体(IgA、IgG、IgM)、补体(C3)、中性粒细胞;(3)不良反应:恶性呕吐等放化疗常见不良反应。结果:试验组与对照组相比,治疗结束后1年的卡氏评分和中位生存期均有显著性差异(P<0.05);治疗后试验组各免疫指标较对照组改善明显,尤其是CD4/CD8(比值)、补体(C3)、外周血白细胞及中性粒细胞水平有显著性意义(P<0.01);化疗带来不良反应发生率试验组较对照组显著降低(29%比71%,P<0.01)。结论:甘露聚糖肽序贯治疗与放化疗联合应用,治疗晚期胃癌,可显著提高患者生存质量,全面增强患者免疫功能,减低放化疗带来的副作用,效果优于胸腺肽序贯治疗。     

心肌梗死大鼠单个核细胞分泌TNF-α对间充质干细胞迁移的影响

目的 探讨心肌梗死(MI)大鼠循环血单个核细胞分泌的TNF-α对间充质干细胞(MSCs)迁移的影响.方法 14只SD大鼠中8只结扎左冠状动脉前降支建立MI模型,其余6只行假手术处理(只穿线不结扎),于第7天时分离大鼠循环血单个核细胞.自制体外三室共培养模型,将4,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)-MSCs、心肌细胞和单个核细胞分别培养于三室模型的上、中、下室内.按下室所加成分的不同,设立MI组(只加入2×106个MI大鼠单个核细胞)、TNF-α中和抗体组(TNF-α-NA组,加入2×106个MI大鼠单个核细胞及终浓度为50ng/L的TNF-α中和抗体)、假手术组(只加入2×106个假手术大鼠单个核细胞)和空白对照组(只加入培养液).共培养48h后,对MSCs迁移细胞进行CD44及CD34免疫组化鉴定和荧光显微镜下计数,ELISA法检测上清液TNF-α含量,Western blotting检测MSCs表面血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达情况,并分析TNF-α含量与MSCs迁移数目的 相关性.结果 迁移细胞CD44呈阳性表达,而CD34呈阴性表达,符合MSCs的特点.与假手术组比较,MI组迁移细胞数量显著增多(P<0.05),TNF-α含量明显升高(P<0.05),而中和TNF-α后,TNF-α-NA组迁移细胞数明显减少(P<0.05).MSCs迁移数目与TNF-α含量呈明显正相关(r=0.969,P<0.05).与假手术组比较,MI组MSCs表面VCAM-1的表达量显著升高(P<0.05),而中和TNF-α后,TNF-α-NA组VCAM-1的表达量明显下降(P<0.05).结论 MI大鼠单个核细胞可促进MSCs迁移,其机制可能与单个核细胞分泌的TNF-α增强MSCs黏附性有关.     

心肌梗死大鼠体外培养心肌组织对间充质干细胞迁移的作用

背景：间充质干细胞具有改善心脏功能的潜力,间充质干细胞移植后向心脏归巢的机制尚不完全清楚。 目的：观察心肌梗死大鼠体外培养的心肌组织对间充质干细胞迁移的作用及可能机制。 方法：建立大鼠心肌梗死模型,培养大鼠心脏组织块,密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,24只SD大鼠随机抽签法分为心肌梗死组、假手术组及正常对照组。假手术组只穿线不结扎,正常对照组不做任何处理。荧光染料DAPI标记间充质干细胞,利用transwell模型进行共培养,共培养48 h。荧光镜下计数迁移细胞数,CD34/CD44免疫细胞化学染色进行迁移细胞定性,免疫荧光检测迁移细胞CXCR4的表达情况,心脏组织切片行免疫组织化学染色检测基质细胞衍生因子1的表达情况并进行平均吸光度分析。 结果与结论：心肌梗死组单位视野迁移细胞数显著高于假手术组(P < 0.05),正常对照组未见迁移细胞。免疫细胞化学染色显示迁移细胞CD44阳性而CD34阴性,符合间充质干细胞特点,其膜受体CXCR4阳性表达。心肌梗死组及假手术组心脏切片基质细胞衍生因子1阳性表达,正常对照组心肌组织不表达基质细胞衍生因子1。心肌梗死组心脏组织基质细胞衍生因子1平均吸光度显著高于其他组别(P < 0.05)。提示心肌梗死后大鼠心脏组织能促进间充质干细胞迁移,这一效应的实现可能与基质细胞衍生因子1-CXCR4轴的作用有关。     

心肌梗死大鼠体外培养心肌组织对间充质干细胞迁移的作用

背景:间充质干细胞具有改善心脏功能的潜力,间充质干细胞移植后向心脏归巢的机制尚不完全清楚.目的:观察心肌梗死大鼠体外培养的心肌组织对间充质干细胞迁移的作用及可能机制.方法:建立大鼠心肌梗死模型,培养大鼠心脏组织块,密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,24只SD大鼠随机抽签法分为心肌梗死组、假手术组及正常对照组.假手术组只穿线不结扎,正常对照组不做任何处理.荧光染料DAPI标记间充质干细胞,利用transwell模型进行共培养,共培养48h.荧光镜下计数迁移细胞数,CD34/CD44免疫细胞化学染色进行迁移细胞定性,免疫荧光检测迁移细胞CXCR4的表达情况,心脏组织切片行免疫组织化学染色检测基质细胞衍生因子1的表达情况并进行平均吸光度分析.结果与结论:心肌梗死组单位视野迁移细胞数显著高于假手术组(P<0.05),正常对照组未见迁移细胞.免疫细胞化学染色显示迁移细胞CD44阳性而CD34阴性,符合间充质干细胞特点,其膜受体CXCR4阳性表达.心肌梗死组及假手术组心脏切片基质细胞衍生因子1阳性表达,正常对照组心肌组织不表达基质细胞衍生因子1.心肌梗死组心脏组织基质细胞衍生因子1平均吸光度显著高于其他组别(P<0.05).提示心肌梗死后大鼠心脏组织能促进间充质干细胞迁移,这一效应的实现可能与基质细胞衍生因子1-CXCR4轴的作用有关.