含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达

目的：构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法：利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3（ζ）和信号肽序列signal。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。结果：经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%。结论：应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）,融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。     

乳腺癌细胞动力学指标与相关基因表达、突变的关系

目的 探讨乳腺癌细胞动力学及凋亡与相关基因表达、突变的关系。方法 采用流式细胞术检测54例乳腺癌DNA指数(DI)、S期细胞比例(SPF)、细胞增殖指数(PI)及细胞凋亡指数(AI)，免疫组织化学法检测原癌基因c—erbB-2、Bcl-2、抑癌基因p53，增殖细胞核抗原PCNA、Ki67及托普DNA酶Ⅱ(TopoⅡ)的表达，PCR—SSCP法检测p53点突变及突变部位、类型；结果 高DI、异倍体率、SPF、PI、AI与c—erbB-2、p53、PCNA、Ki67、TopoⅡ高表达相关。低DI、SPF、PI、AI与Bcl-2高表达相关。高DI、SPF、PI、AI与p53高突变相关，高AI与p53突变类型之一——杂合性缺失(LOH)相关。结论 乳腺癌细胞动力学及凋亡的异常与相关基因的异常表达及突变密切相关。     

乳腺癌发展过程中的bcl-2甲基化及其与蛋白表达的关系

目的建立bcl-2基因甲基化特异的PCR（MSP）检测方法，检测乳腺癌发展过程中的bcl-2甲基化．并探讨bcl-2甲基化与蛋白表达的关系。方法设计bcl-2基因MSP引物，采用MSP方法检测30例正常、25例不典型增生（癌前病变）、40例腋窝淋巴结阴性（癌症初期）和45例腋窝淋巴结阳性（癌症后期）乳腺组织的bcl-2基因5’端启动子CpG岛甲基化状态。另外采用免疫组织化学S-P法检测bcl-2的蛋白表达。结果正常、不典型增生、淋巴结阴性和淋巴结阳性乳腺组织的bcl-2甲基化率分别为10．0％、32．0％、40．0％和53．3％。乳腺癌发展过程中的bcl-2甲基化率渐增（P〈0．01），bcl-2蛋白表达率渐减（P〈0．01）。不典型增生较正常乳腺组织的bcl-2甲基化水平显著提高（P〈0．05）。在乳腺癌发展过程中的4个阶段，bcl-2甲基化与蛋白表达两者之间均呈显著负相关性（P〈0．01）。结论该研究建立了bcl-2基因MSP检测方法，bcl-2基因MSP引物的设计是合理的。bcl-2启动子甲基化可能成为乳腺癌前病变的分子指标之一。在乳腺癌发展过程中，bcl-25’端调控区CpG岛甲基化可能是下调bcl-2表达的因素。     

278例染色体异常的遗传学分析

目的:研究染色体异常与智力低下、习惯性流产夫妇、不育、不孕症、畸胎、死胎史的关系.方法:采用人类外周血淋巴细胞培养,G显带,核型分析.结果:共检出染色体异常278例,其中儿童智力低下病人中检出异常核型147例,占52.84%;习惯性流产、死胎史的病人中检出异常核型12例,占4.31%;不育、不孕的病人检出异常核型99例,占35.61%;原发闭经和继发闭经的病人检出异常核型18例,占6.47%.结论:染色体异常是引起智力低下,习惯性流产、不育不孕症、畸胎死胎史等重要原因之一.     

多次献血者的细胞遗传学研究

目的探讨多次献血对遗传稳定性的影响，试图为指导临床献血提供依据。方法研究多次献血献血员和非献血员健康成人的外周血淋巴细胞的姐妹染色单体交换（ＳＣＥ）频率和微核率。结果多次献血献血员ＳＣＥ频率（４．３３±０．４５）和微核率（５．７６±１．６６）均显著高于非献血员健康成人的ＳＣＥ（３．６０±０．５５）和微核率（４．１４±０．６７）（Ｐ＞０．０１）。而且与持续献血的时间及献血总次数、总量有关。结论多次献血对染色体有明显损伤。     

检测胃癌患者外周血中K-ras和p53基因突变的临床价值

目的 探讨检测胃癌患者外周血中K-ras和p53基因突变的临床意义.方法 应用聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法,对我院收治的73例胃癌患者外周血中的K-ras和p53基因突变进行检测,并与20例非肿瘤疾病患者作对熙.结果 73例胃癌患者中有7例外周血中检测出p53基因突变,阳性率为9.6%;5例检测出K-ras基因突变,阳性率为6.8%.对照组外周血中均未检出K一瑚和p53基因突变.有无肝转移的胃癌患者外周血p53和K-ras基因突变阳性率间差异均有统计学意义(P＜0.05).不同分化程度及临床分期的胃癌患者外周血p53和K-ras基因突变阳性率间差异无统计学意义(JP＞0.05).结论 PCR-SSCP法检测外周血中K-ras和p53基因DNA有助于胃癌肝转移的诊断.     

先天性智力低下儿童的细胞遗传学分析

目的探讨儿童先天性智力低下与染色体异常的关系及异常核型的类型和频率。方法对临床诊断为智力低下、发育落后、先天愚型、先天畸形等的儿童进行外周血细胞培养,G显带染色体核型分析。结果在363例先天性智力低下儿童中,发现染色体异常147例,检出率4050%。21-三体综合征核型143例,占总检出率的9728%,其中21-三体型136例,易位型5例,嵌合型2例。此外还检出非21-三体核型4例,占总检出率的272%。结论先天性智力低下与染色体异常密切相关,异常核型以21-三体型为主,其次为易位型和嵌合型,但同时存在非21-三体核型。     

成人肺癌切除组织和支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达的研究

目的探讨肺癌切除组织和支气管p53基因突变及端粒酶活性表达,并对肺癌切除后的效果进行了评价.方法用PCR-SSCP方法,检测60例肺癌和10例肺良性肿瘤手术切除标本的支气管切缘(切缘病理切片无癌细胞残留)的p53基因突变及端粒酶活性的表达.结果在60例肺癌中有16例(26.7%)肺癌支气管切缘和30例(50.0%)肺癌组织存在p53基因突变及端粒酶活性阳性表达.肺癌切除组织基因突变及端粒酶活性表达为小细胞癌(100%)最高,次为鳞癌(70%)、腺鳞癌(60%)、腺癌(40%).p53基因突变及端粒酶活性表达与TNM分期有关.Ⅲ期(72.7%)最高,其次为Ⅱ期(58.3%),Ⅰ期(25.5%).术后随访3～8个月支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达,10例(62.5%)发生支气管残端复发转移.而p53及端粒酶阴性者术后无残端癌复发.肺癌组织p53及端粒酶阳者中有20例(66.7%)在随访中发现癌复发转移,而p53及端粒酶阴性者中未发现癌复发转移.结论检测支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达,作为肺癌切除后的"分子边界",可作为早期预测肺癌术后残端复发重要依据.     

乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

目的：检测乳腺癌雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）基因启动子区CpG岛甲基化状态,探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达,同时运用甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高（P〈0.05）;ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高（P〈0.05）。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关,后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。