高渗诱导人气道上皮细胞系黏液高分泌

目的研究高渗条件对正常人气道上皮细胞(HBE)黏蛋白(MUC)5AC分泌的影响,以及蛋白激酶C(PKC)-热休克蛋白(HSP)70信号途径在其中的可能作用。方法 采用高渗盐水诱导培养HBE16细胞的方法复制黏液高分泌体外模型,分别用PKCμ抑制剂G 6976、PKCα抑制剂Safingol、PKCβ抑制剂LY333531和PKCδ抑制剂Rot-tlerin干预HBE16细胞。Western blot检测HSP70-2的蛋白含量;RT-PCR检测人HSP70-2转录水平;ELISA检测培养上清MUC5AC蛋白含量c各高渗组的培养上清MUC5AC蛋白含量、HSP70-2蛋白和转录水平较对照组显著升高,并随着培养时间的延长而逐渐增加(P<0.05)。G 6976处理组的上述指标显著降低(P<0.01),但仍高于对照组(P<0.05);而Safingol、LY333531和Rottlerin处理组均无改变。结论 高渗盐水可诱导人气道上皮细胞MUC5AC的高分泌,HSP70-2系通过PKC中的μ亚型在该过程中起重要作用的。     

Elafin在人支气管上皮细胞系16HBE胞质内对黏蛋白5AC生成的影响

目的 探讨Elafin在胞质内对表皮生长因子(EGF)诱导的黏蛋白(MUC)5AC生成的影响及其作用机制.方法 体外培养人支气管上皮细胞系16HBE,将已构建好的pEGFP-N1-Elafin载体通过LipofectamineTM2000转染到16HBE细胞中,以转染空质粒载体的16HBE细胞作为对照,均给予外源性EG...     

依赖Ca2+的ATP过量释放在机械牵张所致气道上皮黏蛋白5AC高分泌中的作用

目的探讨人气道上皮细胞三磷酸腺苷(ATP)释放量的改变在机械通气所致气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞(HBE16)体外培养,通过节律性倾斜细胞培养板,利用液体的表面张力、大气压及液体重力所产生的牵张力(剪应力)及压力(压应力)给予压力牵张刺激,并利用向密闭盒中注入医用氧气增加压力以模拟机械通气,各组培养细胞依施加条件不同而分为对照组、单纯倾斜组、倾斜+钙离子螯合剂BAPTA-AM、倾斜+BAPTA-AM+钙离子螯合剂EGTA、加压+倾斜、加压+倾斜+嘌呤P2Y受体阻断剂reactive blue-2(RB-2)、加压+倾斜+BAPTA-AM、加压+倾斜+BAPTA-AM+EGTA,共8组,分别采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞活性、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平、ELISA法检测细胞培养上清液中MUC5AC含量、高效液相色谱法(HPLC)检测培养液中ATP释放量。结果加压+倾斜组细胞MUC5AC mRNA相对含量、培养上清液中ATP释放量和MUC5AC蛋白分泌量分别为:(11.80±0.01)、(7.41±0.45)μmol/g、(0.77±0.26),显著高于单纯倾斜组的(6.60±0.01)、(2.76±0.47)μmol/g、(0.25±0.01)及对照组的(3.40±0.01)、(0.00±0.01)μmol/g、(0.02±0.01)(均P<0.05)。RB-2、EGTA+BAPTA-AM处理后的加压+倾斜组细胞的MUC5AC mRNA相对含量分别为:(10.5±0.03)、(11.9±0.11),与加压+倾斜组相比抑制作用不显著(P>0.05);培养上清液中ATP释放量分别为:(0.05±0.02)μmol/g、(0.08±0.02)μmol/g,较加压+倾斜组显著降低(均P<0.05)。结论机械通气可以显著提高气道黏膜上皮MUC5AC的分泌,其机制与气道上皮细胞依赖Ca2+的ATP的过量释放密切相关。     

机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白5AC表达的影响及其信号通路机制研究

目的观察机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白(MUC)表达的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨。方法采用多功能小型生物撞击机构建体外培养的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的三条主要通路抑制剂:JNK抑制剂(SP600125)、p38蛋白激酶抑制剂(SB203580)及ERK1/2抑制剂(U0126)(浓度均为30μmol/L),并设未进行机械牵张的对照组和单纯机械牵张组。采用流式细胞仪检测牵张前后胞内游离Ca2+荧光强度的变化,激光共聚焦显微镜观察胞内游离Ca2+的分布情况,并分别采用RT-PCR和ELISA方法检测MUC5AC mRNA表达和蛋白分泌量。结果牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞胞内Ca2+浓度、MUC5AC mRNA和蛋白表达(均P<0.01)。U0126和SB203580能抑制牵张所致MUC5AC mRNA和蛋白表达增加(均P<0.01)。结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞黏蛋白表达,其机制可能与胞内Ca2+浓度的升高以及ERK1/2、p38 MAPK信号通路有关。     

JNK信号通路介导机械牵张引发的肺泡巨噬细胞炎性因子表达

目的 观察不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞白介素-6(IL-6)和巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)的影响,并探讨C-JUN氨基末端激酶(JNK)对机械牵张诱导的大鼠肺泡巨噬细胞IL-6和MIP-2表达的调控作用.方法 采用支气管肺泡灌洗的方法取得大鼠肺泡巨噬细胞,并建立体外大鼠肺泡巨噬细胞梯度应力的机械牵张模型,应用RT-PCR和Western印迹方法观察IL-6和MIP-2的表达.进一步应用JNK特异性抑制剂SP600125,p38特异性抑制剂SB203580,及ERK特异性抑制剂PD98059给予同期干预,检测干预效果.结果 随着机械牵张应力的增大,肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和其蛋白的表达递增(均P<0.05).给予SP600125干预组大鼠肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA 和蛋白表达较机械牵张处理组明显降低.SB203580干预组及PD98059干预组的肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和蛋白水平较对照组明显升高,而与机械牵张处理组相比无明显变化.而IL-6 mRNA及其蛋白水平在上述各组中均无明显变化.结论 大鼠巨噬细胞MIP-2的表达与机械牵张应力呈强度依赖性,JNK信号通路在周期性牵张诱导肺泡巨噬细胞表达释放MIP-2过程中起重要作用.     

呼吸机机械通气对兔气道黏蛋白表达的影响

目的 观察呼吸机机械通气对黏蛋白(MUCSAC)表达的影响,并对其机制进行初步探讨.方法 日本大耳兔随机分为对照组、机械通气1、3、6、12和24 h组以及2、5和10 cm H<,2>O呼气末正压(PEEP)组.取支气管肺泡灌洗液(BALF),用ELISA和RT-PCR法检测BALF中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介...     

皮层肌动结合蛋白不同位点磷酸化对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的影响

目的：了解皮层肌动结合蛋白(cortical actin-binding protein,又称cortactin)在人气道上皮细胞黏蛋白(mucin,MUC)5AC分泌中的作用及不同磷酸化位点对其的影响。方法：培养人气道上皮细胞HBE16,以皮层肌动结合蛋白不同磷酸化位点突变载体转染细胞,并分为空白对照组、剪应力刺激组、剪应力+增强绿色荧光蛋白质粒(enhanced green fluorescent protein plasmid, pEGFP)-N1组、剪应力+pEGFP-N1-cortactin (Cort)组、剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y470A组及剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y486A组,剪应力设定为4 dynes/cm2。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、real-time PCR法测定转染前后各组细胞及培养上清中MUC5AC蛋白和mRNA水平,Western印迹检测各组皮层肌动结合蛋白及磷酸化皮层肌动结合蛋白含量;异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)的分布情况。结果：4 dynes/cm2 剪应力刺激30 min后,细胞中磷酸化皮层肌动结合蛋白表达增加,在2 h时表达水平最高;剪应力刺激2 h后,MUC5AC mRNA表达增强,细胞及培养上清中MUC5AC的含量与空白对照组相比,各组均显著增加(均P<0.05);与剪应力刺激组相比,剪应力+pEGFP-N1-cortactin(Cort)组的细胞培养上清液中MUC5AC蛋白含量显著增加,F-actin在胞膜的分布也明显增多(均P<0.05),而胞质内MUC5AC蛋白及MUC5AC mRNA水平变化不大。与剪应力+pEGFP-N1-Cort组相比,剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y470A组培养上清液中的MUC5AC蛋白含量有明显降低,F-actin在胞膜的聚集也有所减少(均P<0.05),而剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y486A组中MUC5AC含量变化不明显(P>0.05)。结论：皮层肌动结合蛋白参与了剪应力诱导产生的人气道上皮细胞MUC5AC蛋白分泌,Tyr421和Tyr470位点磷酸化在其中可能起重要的作用。     

慢性阻塞性肺病患者冷敏受体高表达及其临床意义

目的 探讨瞬时受体电位蛋白-8(TRPM8)在慢性阻塞性肺病(COPD)患者与正常人气道黏膜上皮组织的表达差异及其信号传导机制.方法 免疫组化法观察TRPM8蛋白在气道黏膜上皮分布特点及表达差异,RT-PCR及Western bolt检测TRPM8 mRNA及其蛋白表达.体外培养16HBE细胞(n=5),分为对照组(37℃)、冷刺激组、冷刺激+BCTC组、冷刺激+转染TRPM8 shRNA组、冷刺激+转染对照组,以18℃冷空气刺激细胞,激光共聚焦检测胞内Ca2+相对浓度.结果 TRPM8蛋白主要分布于支气管黏膜上皮基底细胞或小颗粒细胞的细胞膜,COPD组累积吸光度/面积比值、TRPM8 mRNA及其蛋白表达量显著高于对照组(P＜0.05).冷刺激组的Ca2+浓度显著高于对照组(P＜0.05),BCTC、转染TRPM8 shRNA组较前者明显下降(P＜0.05).结论 COPD患者气道黏膜上皮TRPM8蛋白高表达可能是其对冷空气敏感的重要原因之一.     

Elafin在肿瘤坏死因子-α诱导的炎性反应中的抗炎机制

目的探讨Elafin的抗炎机制。方法体外培养人支气管上皮细胞系16HBE细胞,将已构建好的pEG-FP-N1-Elafin载体转染到细胞中,并以空质粒载体作其对照,以外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α作为刺激物共同孵育。间接免疫荧光细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测细胞核中核因子(NF)-κB的活性,ELISA检测细胞上清液中炎性介质(选取IL-1β、IL-8作为代表)的含量,免疫共沉淀法结合Western blot检测小泛素样修饰蛋白(SU-MO)-1-p-IκBα含量。结果重组质粒组的细胞中NF-κB的活性和IL-1β、IL-8的生成量与空质粒载体组细胞相比明显降低,而SUMO-1-p-IκBα的含量则显著升高(P<0.01)。结论Elafin能够通过促进IκBα的类泛素化阻止NF-κB的活化,下调前炎性介质的生成,从而发挥其抗炎作用。     

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目的：观察不同压力对家犬气道黏液层黏蛋白(MUC)分泌的影响,并初步探讨其参与机制。方法：24只健康家犬行双腔支气管导管插管,并随机分为4组(n=6)。A组家犬正常呼吸的频率及压力双侧通气(A1,A2);B组一侧不通气(B1),另一侧予以过量通气(B2);C组预先张力敏感性阳离子通道4(TRPV4)阻断剂钉红(RR)后按A组通气模式通气(C1,C2);D组预先TRPV4阻断剂RR处理后按B组通气模式通气(D1,D2)。通气12 h后,ELISA检测3组支气管灌洗液(BALF)中MUC(2,5AC和5B)蛋白含量;RT-PCR检测支气管肺组织匀浆中MUC(2,5AC和5B) mRNA转录水平。结果：与正常通气的A2组比较,过量通气的B2组家犬BALF中3种MUC蛋白含量显著升高,且以MUC5AC为主(P<0.05);与A1组比较,未通气的B1组则明显下降(P<0.05)。与A1,A2组比较,给予RR处理后的C1,C2组蛋白含量均明显降低(P<0.05)。与过量通气的B2组比较,给予TRPV4特异性阻断剂处理后再过量通气的D2组3种MUC蛋白含量亦明显下降(P<0.05)。与A2组比较过量通气的B2组肺组织MUC(2,5AC和5B) mRNA表达均明显上调(P<0.05);与A1,A2比较,给予RR处理后C1,C2组肺组织3种MUC mRNA转录水平显著下降(P<0.05);给予RR预处理后与B2组相比,D2组内MUC mRNA转录水平显著下调(P<0.05)。结论：节律性压力波参与维持家犬气道上皮黏液层黏蛋白分泌平衡调控,其机制主要通过TRPV4通道实现。