多组学分析发现LAMC2是调节泛癌微环境的关键因子

目的 利用多种数据库对多黏连细胞外基质蛋白LAMC2进行了系统分析,多组学数据证明LAMC2是影响患者肿瘤发生和临床预后的关键分子.方法 利用数据库分析了各种肿瘤及正常组织中LAMC2的蛋白质和RNA的表达量.并且比较了不同肿瘤类型间的LAMC2表达量与肿瘤患者生存间的关系,并进行免疫浸润分析;比较了在不同肿瘤类型中L...     

基因Cdca2敲除对小鼠精子发生和生育力无明显影响

目的 探究睾丸高表达细胞分裂周期相关蛋白2基因(Cdca2)在小鼠精子发生和生育力中的生理功能。方法 通过Q-PCR和Western blot检测Cdca2在小鼠不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-loxP介导的重组系统构建Cdca2组织特异性敲除的小鼠品系;通过苏木精-伊红(HE)染色和形态学分析了解小鼠CDCA2缺失对精子发生的各个阶段生精细胞形态的影响;通过精子全自动检测分析系统检测小鼠CDCA2缺失对精子活率及运动参数的影响;通过生育力测试实验检测CDCA2缺失对雄性小鼠生育能力的影响。结果 Cdca2是一个睾丸高表达的基因;利用CRISPR/Cas9技术和生殖系统特异性Cre的工具鼠,成功获得了Cdca2生殖细胞特异性敲除的小鼠;小鼠CDCA2缺失对精子发生中各阶段生精细胞、精子运动参数及雄性生育能力的影响改变无统计学意义。结论 基因Cdca2对于小鼠精子发生和雄性生育力的维持可能是非必需的。     

基于转录组测序鉴定自噬在小鼠精子发生过程中的动态变化

目的基于NCBI数据库中的小鼠精子发生3个时期(精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子)的转录组测序(RNA-Seq)数据,系统地揭示自噬通路及自噬相关基因在精子发生过程中的动态变化规律。方法从GEO数据库中下载精子发生3个时期的RNA-Seq数据(GSE100964),对相邻阶段的差异表达基因分别进行代谢通路富集分析。从Autophagy Database里面取出783个自噬相关基因,对其中在精子发生3个时期的平均表达值大于1的636个自噬相关基因的表达量进行热图展示。结果发现精原细胞和粗线期精母细胞之间的差异表达基因可以显著富集到自噬通路和自噬相关的通路,而粗线期精母细胞和圆形精子之间的差异表达基因不能富集到自噬相关通路。此外,还发现636个自噬相关基因在精子发生过程中有3种主要表达模式。结论自噬在精子发生减数分裂起始前后的RNA水平发生了显著的变化,且自噬相关基因在精子发生过程中呈阶段特异表达。     

腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

目的建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统。方法利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee1 2#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas9细胞验证该载体的基因敲除效率。筛选睾丸组织特异表达基因Sycp3的sgRNA靶点,构建入AAV-sgRNA(新版)载体中,进行病毒包装,利用显微注射技术将病毒注射入小鼠睾丸组织曲细精管内,通过T7E1分析体内细胞的基因敲除效果。结果构建成功的AAV-sgRNA载体能够进行病毒包装并在体外细胞水平上对人源Wee1进行基因编辑,与慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统中的载体编辑效率相比无明显差异。同时,该系统能在体内水平对Sycp3进行基因编辑。结论成功建立一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的思路和方法。     

敲除基因Pabpc6对雄性小鼠精子发生的影响

目的 探究小鼠细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-6(PABPC6)在雄性小鼠精子发生中的作用。方法 利用CRISPR/Cas9靶向敲除C57BL/6J小鼠基因Pabpc6,通过PCR鉴定Pabpc6的敲除情况。通过交配繁殖得到Pabpc6^+/+、Pabpc6^+/-、Pabpc6^-/- 3种不同基因型的小鼠，进行睾丸称重、形态学观察和精子计数。RT-qPCR和Western blot检测不同组织中Pabpc6在mRNA和蛋白的表达水平；通过免疫荧光和苏木精-伊红染色观察该基因的定位以及睾丸曲细精管内部形态学变化。结果 成功鉴定出敲除Pabpc6的小鼠；Pabpc6在睾丸组织中高表达(P<0.001)。免疫荧光显示该基因主要表达于精母细胞和早期精子阶段，基因敲除小鼠与野生型小鼠相比在睾丸外形、精子形态、精子数量和曲细精管内部形态上没有明显差异。结论 Pabpc6在小鼠睾丸组织中高表达，敲除该基因后对雄性小鼠的精子发生无明显影响，说明该基因所编码的蛋白对于小鼠精子发生过程可能是非必需的。