BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究北大核心CSCD

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。     

携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用

目的:探讨携带凋亡素基因(apopptin)的溶瘤腺病毒ATV感染对人宫颈癌HeLa 细胞自噬和凋亡的影响。方法: 分别用携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV与对照病毒Ad-MOCK(均为前期工作构建）感染HeLa 细胞后,应用WST-1 法检测ATV感染对HeLa 细胞增殖的影响,流式细胞术检测ATV感染对HeLa 细胞凋亡和细胞周期的影响,Western blotting 法检测ATV感染对HeLa 细胞自噬相关蛋白LC3、P62 与mTOR表达的影响,MDC染色法检测ATV 感染对HeLa 细胞自噬水平的影响。结果:ATV感染后抑制HeLa细胞增殖,并具有一定的时间效应关系;以ATV 100 MOI感染72 h 后抑制率达到59.26%,其抑制能力明显强于同时间段对照组(P<0.01)。ATV 感染48 h,ATV 组HeLa 细胞凋亡率显著高于对照组[(38.995±4.009)% vs (14.680±1.174)%,P<0.01]。感染后的HeLa 细胞,随着ATV 作用时间的延长,S 期出现阻滞,48 h 阻滞最强,显著高于对照组[ 58.490±2.447)% vs (43.235±4.419)%,P<0.05]。与对照组相比,ATV 感染HeLa 后,LC3 表达量6、12 h 逐渐增高,12 h 达到最大值（P<0.01）,24 h 表达量最低（P<0.01）;P62 蛋白在24 h 出现最高表达水平（P<0.01）;而mTOR随着作用时间延长逐渐降低（48 h 时,P<0.01）。荧光显微镜下可见HeLa细胞核周区域MDC阳性染色,随着ATV作用时间延长,自噬小体明显增多;与对照组相比,6、12h 自噬小体数量显著增多(28.000±2.828) vs (8.500±2.121), (37.000±4.243) vs (14.000±1.414);均P<0.01],24 h 相对减少[(12.000±2.828) vs (17.000±1.414),P<0.01]。结论: 携带凋亡素基因的ATV溶瘤腺病毒可促进人宫颈癌HeLa 细胞的凋亡和自噬水平,进而特异性杀伤肿瘤细胞。     

携Apoptin和PEG3启动子双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的抑制作用

目的： 探讨携带凋亡素基因（Apoptin）和进行性增量基因3（progression-elevated gene 3, PEG3）启动子的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌的体内、外抑制效果。方法： 以Ad-Apoptin-PEG3p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock（均为前期工作构建）分别感染人结直肠癌SW1116细胞和胃黏膜上皮GES细胞,MTT法检测感染后细胞的增殖水平; 流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用DCFH-DA和Rho123染色流式细胞术分别检测细胞活性氧水平和线粒体膜电位,Western blotting检测细胞色素C的释放。建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,观察Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌皮下移植瘤的抑制作用。结果： Ad-Apoptin-PEG3p-E1a抑制SW1116细胞增殖,并具有一定的剂效和时效关系,以MOI=100感染72 h后抑制率达到（56.23±664）%,其抑制能力明显强于Ad-pEG3p-E1a和Ad-Apoptin等对照组（均P<0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a感染导致SW1116细胞活性氧水平上调、线粒体膜电位下降以及细胞色素C释放增加,最终诱导SW1116细胞凋亡,凋亡率为（37.97±3.78）%,但对正常GES细胞的上述各项指标均无明显影响。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a能显著抑制小鼠皮下移植瘤生长（P<0.05）;有效延长模型动物平均生存期,Ad-Apoptin-PEG3p-E1a治疗组平均生存期为（41.0±0.7）d,显著高于Ad-PEG3p-E1a的（34.4±1.6）d、Ad-Apoptin的（33.2±1.2）d和Ad-mock的（28.4±14）d （均P<0.05）。结论： Ad-Apoptin-PEG3p-E1a可以特异性有效抑制结直肠癌细胞增殖及皮下移植瘤的生长。     

新补骨脂异黄酮通过caspase-3/GSDME通路诱导肝细胞癌Huh-7细胞焦亡

目的：探讨新补骨脂异黄酮（NBIF）对肝细胞癌（HCC）Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法：体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞的LDH释放量,WB实验检测细胞中GSDME、caspase-3的蛋白水平变化。采用si RNA干扰Huh-7细胞中caspase-3、GSDME表达后,CCK-8法检测NBIF处理对细胞存活率的影响,WB实验检测GSDME蛋白表达水平,观察NBIF处理对细胞形态的影响,并检测细胞LDH释放量。结果：60μmol/L以上的NBIF均能显著抑制Huh-7细胞的增殖（均P<0.01）,光学显微镜下观察到NBIF处理后的细胞出现肿胀、吐泡现象,且LDH释放增加（P<0.01）;WB实验结果表明,NBIF能够激活caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白,增加GSDME-N的表达（均P<0.01）。干扰caspase-3、GSDME表达后,NBIF对细胞的抑制作用减弱（均P<0.01）,G...     

Ad-apoptin通过AMPK/ACC信号通路抑制肺癌细胞脂代谢北大核心CSCD

目的:探讨溶瘤腺病毒Ad-apoptin对非小细胞肺癌细胞脂代谢的影响及分子机制。方法:CCK-8法检测细胞活性;JC-1染色和Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡;Western blot检测脂代谢和凋亡相关蛋白;siRNA干扰肺癌细胞AMPK的表达;Co-IP检测Ad-apoptin与AMPK蛋白相互间作用;建立移植瘤小鼠模型,检测肿瘤的生长,并通过免疫组化检测TUNEL、Ki-67、p-AMPK和FASN蛋白表达量。结果:Ad-apoptin对肺癌细胞抑制率具有浓度依赖性(P<0.05),显著诱导细胞凋亡(P<0.05),降低细胞脂质累积,下调三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)含量,上调p-AMPK和p-ACC;敲低AMPK可显著减弱Ad-apoptin诱导的凋亡,而抑制ACC可显著增强Ad-apoptin诱导的凋亡。在体内试验中,Ad-apoptin能抑制体内肿瘤生长,同时也能抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡。结论:Ad-apoptin以AMPK为靶点,通过AMPK/ACC途径,抑制肿瘤增殖和脂代谢并促进细胞凋亡。     

SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并...     

贝母素乙通过诱导G0/G1期阻滞抑制结肠癌细胞的增殖

目的：探讨贝母素乙对结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：利用不同浓度的贝母素乙处理人结肠癌细胞HCT116和正常结肠上皮细胞CCD841 CON,通过CCK-8法和结晶紫染色法检测贝母素乙对HCT116和CCD841CON细胞增殖活力的影响,流式细胞术和WB法检测贝母素乙对HCT116细胞周期及其细胞周期相关蛋白表达的影响。构建HCT116移植瘤裸鼠模型和AOM/DSS结肠癌小鼠模型,观察贝母素乙对小鼠模型肿瘤生长和OS的影响,免疫组化法和WB法检测对移植瘤或肿瘤组织中细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6和cyclin D1表达的影响。结果：贝母素乙可显著抑制结肠癌HCT116细胞的增殖能力（P<0.01）,诱导HCT116细胞周期G0/G1期阻滞（P<0.01）,降低CDK4、CDK6和cyclin D1的蛋白表达水平（均P<0.01）。荷瘤小鼠实验结果显示,贝母素乙（0.75 mg/kg）显著抑制HCT116细胞移植瘤的生长并延长荷瘤裸鼠的OS(P<0.05或P<0.01),降低AOM/DSS模型小鼠的体质量、延长OS、减少癌变肠组织...     

重组腺病毒Ad-HP 对胃癌的抑制作用

目的:探讨表达HN蛋白的重组腺病毒Ad-HP在体内外对人胃癌细胞的抑制作用。方法:通过MTS法检测Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)对SGC7901细胞的增殖抑制效果,采用Annexin V染色、Caspase酶活性检测、Western blot免疫印迹检测揭示Ad-HP对SGC7901细胞的抑制方式和途径。对BALB/c裸鼠进行瘤内注射Ad-HP探究其在体内的抗肿瘤作用。结果:体外实验中Ad-HP明显抑制SGC7901细胞增殖,并表现出时间效应和剂量效应关系。Ad-HP能提高Caspase酶活性,并释放细胞色素C。体内实验中Ad-HP能显著延缓瘤体生长并延长模型动物的平均生存期,而且能上调IL-2和IFN-γ等细胞因子,使免疫反应朝向Th1优势。结论:Ad-HP可特异性有效抑制胃癌细胞增殖和肿瘤生长。     

重组溶瘤腺病毒对荧光素酶标记和非标记人肺癌A549 细胞抑制作用比较

目的:探讨重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A(ATV)对荧光素酶标记人肺癌细胞（A549-luc）和人肺癌细胞（A549）的体外抑制作用差异。方法：利用ATV分别感染A549 细胞和A549-luc 细胞,通过WST-1 和结晶紫染色法确定ATV的抑制作用的差异性,通过Hoechst 和Annexin V-FITC/PI 染色验证ATV的抑制方式。结果：ATV对A549 和A549-luc 细胞均具有明显抑制作用（P<0.05）。ATV在24、48、72 h 对两种细胞均有明显抑制作用（P<0.05 或P<0.01）,且72 h 抑制率最强;剂量分别为1、10 和100 MOI的ATV对两种细胞均有抑制作用,且100 MOI抑制率最高。A549 细胞和A549-luc 细胞感染ATV后,均呈现核碎裂典型浓染和边集的凋亡现象,且凋亡率随时间的增加而增大,具有显著的时间效应（P<0.05 或P<0.01）,且凋亡率均在72 h 达到峰值。结论：荧光素酶的插入没有明显改变ATV对A549-luc 细胞的抑制作用和抑制方式,ATV是通过诱导A549-luc 细胞和A549细胞凋亡从而达到对其显著性体外抑制作用.     

光甘草定对肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制

目的：探讨光甘草定对肺腺癌细胞A549 恶性生物学行的影响及其分子机制。方法：常规方法培养A549 细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,用不同浓度的光甘草定和或顺铂对其进行处理,通过结晶紫染色、CCK-8 法检测光甘草定、顺铂对A549、BEAS-2B细胞增殖活力的影响,Transwell 小室实验、细胞划痕实验检测光甘草定对A549 细胞侵袭、迁移能力的影响,流式细胞术检测光甘草定对A549 细胞凋亡的影响,3D超低黏附板培养法培养A549 细胞后采用CCK-8法检测光甘草定对A549 细胞增殖的影响,WB法检测光甘草定对A549 细胞中上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达的影响;构建A549 细胞移植瘤模型后检测光甘草定、顺铂对移植瘤的生长以及移植瘤组织中EMT相关蛋白表达的影响。结果：光甘草定、顺铂呈剂量依赖性地显著抑制A549 细胞的增殖（P<0.05 或P<0.01）、细胞迁移（P<0.05 或P<0.01）和侵袭能力（P<0.05 或P<0.01）,光甘草定能诱导A549 细胞凋亡（P<0.01）,抑制A549 细胞中N-cadherin、snail 和vimentin 蛋白的表达,促进E-cadherin 蛋白表达;光甘草定、顺铂均能抑制A549移植瘤的生长,抑制移植瘤组织中Ki67、N-cadherin、snail 和vimentin 蛋白的表达、促进E-cadherin 蛋白的表达。结论：光甘草定可通过抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导A549细胞凋亡,其机制可能与其抑制细胞的EMT进程而产生抑癌作用有关。