小鼠Cpne5基因mRNA水平的表达分布及其在胚胎的表达定位

目的明确小鼠Cpne5基因在mRNA水平的组织表达分布及其在胚胎的表达定位。方法提取新生、成年小鼠主要脏器的总RNA,利用RT-PCR法检测Cpne5 mRNA的表达量;合成针对Cpne5 mRNA的杂交探针,取不同胎龄胎鼠进行整体原位杂交。结果 Cpne5 mRNA在成年小鼠10种脏器组织均有不同程度的表达,以大脑,小脑,睾丸和肺脏表达量较高;而肝脏和肌肉未表达。新生小鼠9种脏器中,Cpne5表达量最高的是脑组织,眼和肾次之,肺和肝脏表达量很少。制备并评估Cpne5原杂探针的产量,SP6转录的反义探针浓度为100ng/μL,T7转录的正义探针浓度为10ng/μL,原位杂交结果显示Cpne5 mRNA主要表达于胎鼠的端脑、间脑、中脑及菱脑原节。结论在新生和成年小鼠的脑组织中Cpne5基因mRNA高水平表达,并在胎鼠发育过程中定位于胎脑。     

SH-SY5Y细胞凋亡过程中Cpne5蛋白表达的变化

目的探讨Cpne5蛋白在SH-SY5Y细胞凋亡中表达量的变化。方法显微镜观察细胞形态及流式细胞术检测凋亡率,鉴定A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡及血清剥夺诱导凋亡的模型;免疫印迹法检测两种凋亡过程中Cpne5蛋白表达量的变化。结果 10μmol/L A23187诱导SH-SY5Y细胞24h,细胞出现皱缩、凋亡率增加。A23187诱导0.5h,Cpne5蛋白表达量即出现明显的上升,持续至12h;在24h时Cpne5蛋白表达量回落至诱导前水平。血清剥夺72h的SH-SY5Y细胞24份,凋亡率为23.2±2.1%,与对照组1.1±0.1%比,差异有统计学意义（P〈0.01）。免疫印迹结果表明,SH-SY5Y细胞分别经血清剥夺1h、6h、12h、24h、72h对Cpne5蛋白表达量无明显变化。结论 A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡早期Cpne5蛋白表达量有显著变化;提示Cpne5基因可能参与凋亡调控的钙信号通路。     

CPNE5对NF-κB转录调控活性的影响

目的:研究CPNE5对TNF-α诱导的NF-κB转录激活活性的影响,并探讨其作用机制.方法:用10 ng/mlTNF-α处理转染了pcDNA3.1或pcDNA3.1-CPNE5的HEK293细胞,用双荧光素酶报告基因实验检测不同转染组NF-κB的转录激活活性;Western印迹和细胞免疫荧光技术检测CPNE5表达上调对NF-κB入核的影响;凝胶阻滞实验研究CPNE5表达上调对NF-κB DNA结合能力的影响.结果:CPNE5可以显著抑制TNF-α对NF-κB的转录激活活性(P<0.0001);CPNE5不影响TNF-α诱导的NF-κB(P65)入核;CPEN5过表达降低了TNF-α诱导的NF-κB与DNA结合的能力.结论:CPNE5通过抑制NF-κB的DNA结合活性抑制TNF-α诱导的NF-κB转录激活活性.     

人CPNE5多克隆抗体的制备

制备人CPNE5的多克隆抗体.将CPNE5基因中423bp(626-1048bp)的片段构建到原核表达载体pGEX-5X-1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达蛋白,经SDS-PAGE分离纯化得到抗原肽段,质谱法鉴定后常规免疫家兔.用CL-4B柱纯化抗体.结果显示,成功表达并纯化了人CPNE5抗原肽段...     

CPNE5的A结构域对肿瘤坏死因子α诱导核因子κB活化的影响

[目的]研究CPNE5的A结构域(AD)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)激活核因子κB(NF-κB)转录活性的调控作用。[方法]用PCR法扩增AD序列,将其构建EGFP-N1载体上,在真核细胞中表达融合蛋白AD-GFP。以连有κB序列和表达水平受κB序列调控的荧光素酶基因的质粒为报告基因载体,将EGFP-N1、AD-GFP质粒分别与报告基因共转染到HEK293细胞中,经TNF-α处理后,用双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶的活性,检测它们对NF-κB转录活性的影响。[结果]构建了AD-GFP质粒;A结构域能够显著抑制NF-κB转录活性(P<0.05);AD对NF-κB转录活性的抑制具有剂量依赖性。[结论]CPNE5的A结构域能够剂量依赖性抑制NF-κB的转录激活活性。     

外源表达人CPNE5诱导细胞内质网应激反应

目的:探讨外源表达人CPNE5诱导细胞发生内质网应激反应的机制.方法:分别转染空载体pcDNA4和人CPNE5编码区序列的真核表达质粒pcDNA4-CPNE5至HEK293细胞,48 h后收集细胞,通过RT-PCR、Western印迹检测基因mRNA及蛋白的表达.结果:外源表达人CPNE5蛋白可以上调内质网应激特征分子GRP78、CHOP、JNK1基因的表达.结论:外源表达人CPNE5可以诱导HEK293发生内质网应激反应.     

Semaphorins与肿瘤的发生和转移

Semaphorins是一大类具有保守Sema结构域的信号蛋白。该家族分为8个亚群，目前已发现30多个成员，有分泌型、跨膜型和GPI锚定3种类型。在病毒、非脊椎动物和脊椎动物中都已发现Semaphorins分子的存在。该家族蛋白主要有2种受体：plexins和neuropilins，它们对Semaphorins功能的发挥非常重要。Semaphorins首先是作为神经系统中一种重要的神经导向分子而被发现和认识的。起初的研究多围绕其在神经系统轴突导向中所发挥的作用而进行，发现Semaphorins分子可以抑制或促进轴突的生长。但现在越来越多的研究表明，除了在神经系统中具有重要作用外，Semaphorins分子在肿瘤生长、血管内皮细胞迁移、免疫反应等方面也有重要的生物学功能。Semaphorins分子通过促进或抑制肿瘤血管发生而对肿瘤的发生发展进行调节。