热休克蛋白90α(HSP90α)在大肠杆菌中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 90α的生物学功能 ,获得高质量及充足的HSP90α蛋白。方法 :采用PCR的方法扩增HSP90αcDNA5’端 42 4bp片段 ,在起始密码子位置制造一个NcoI酶切位点 ,将PCR产物克隆到中间载体 ,再通过合适的酶切位点将其余片段连接到此载体 ,形成一个带有NcoI突变位点的HSP90αcDNA全长克隆。最终将HSP90α全部编码cDNA插入到pET 16b表达载体中。结果 :经诱导表达 ,SDS PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约 83kD处有一诱导蛋白带。WesternBlot证明表达产物与抗HSP90α抗血清有特异的免疫反应。结论 :构建成了T7启动子控制下的HSP90α表达质粒。     

热休克蛋白90a（HSP90a）在大肠杆菌中的表达

目的：探讨热休克蛋白９０α的生物学功能,获得高质量及充足的ＨＳＰ９０α。方法：采用ＰＣＲ的方法扩增ＨＳＰ９０ａｃＤＮＡ４５’端４２４ｂｐ片段,在起始密码子位置制造一个Ｎｃｏｌ酶切位点,将ＰＣＲ产物克隆到中间载体,再通过合适的酶切位点将其余片段边接到此载体,形成一带有Ｎｃｏｌ突变位点的ＨＳＰ９０ａｃＤＮＡ全长克隆。最终将ＨＳＰ９０ａ全部编码ｃＤＮＡ插入到ｐＥＴ－１６ｂ表达载体中。结果：经诱导表达,Ｓ     

表达反义单核细胞趋化蛋白-1的重组逆转录病毒对家兔动脉平滑肌单核细胞趋化蛋白-1基因表达的影响

为研究反义单核细胞真挚化蛋白－１转基因表达对单核细胞进入动脉壁的作用,首先,构建了表达反义单核细胞趋化蛋白－１基因的逆转录病道理毒重组体,并观察它在培养的细胞中的表达。将家多单核细胞趋化蛋白－１ｃＤＮＡ反向插入到ｐＬＮＣＸ,构成ＬＮＣＸ－ａｎｔｉ－ＭＣＰ－１重组病毒质粒。再将重组质粒转染Ψ－２细胞,继以Ψ－２细胞产生的病毒上清感染ＰＡ３１７细胞,取得Ｇ４１８ＰＡ３１７抗细胞克隆。上述细胞经扩增培养     

表达反义单核细胞趋化蛋白-1的重组逆转录病毒对家兔动脉平滑肌单核细胞趋化蛋白-1基因表达的影响

为研究反义单核细胞趋化蛋白－１ 转基因表达对单核细胞进入动脉壁的作用,首先构建了表达反义单核细胞趋化蛋白－ １ 基因的逆转录病毒重组体,并观察它在培养的细胞中的表达。将家兔单核细胞趋化蛋白－ １ ｃＤＮＡ 反向插入到ｐＬＮＣＸ,构成ＬＮＣＸ－ａｎｔｉ－ ＭＣＰ－１ 重组病毒质粒。再将重组质粒转染φ－２ 细胞,继以φ－ ２ 细胞产生的病毒上清感染ＰＡ３１７细胞,取得Ｇ４１８ＰＡ３１７ 抗细胞克隆。上述细胞经扩增培养,收集病毒上清并感染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞后进行检测。结果发现,病毒的滴度为５．６×１０７ ＣＦＵＬ,感染的ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞中有重组病毒的整合。重组病毒感染培养的家兔动脉平滑肌细胞后,用聚合酶链反应检测发现,感染的平滑肌细胞基因组ＤＮＡ中有重组病毒整合;ＲＮＡｓｌｏｔ 杂交结果显示,感染的平滑肌细胞中有反义单核细胞趋化蛋白－１ 的表达,与未感染的平滑肌细胞相比,感染的平滑肌细胞中单核细胞趋化蛋白－ １ ｍＲＮＡ 的表达明显受到抑制。结果提示,反义单核细胞趋化蛋白－ １ 逆转录病毒表达载体在培养的动脉平滑肌中能表达反义基因并抑制靶基因的表达,为进一步开展体内实验研究奠定了基础     

热休克蛋白90α的表达及其对体内肿瘤生长的影响

目的 探讨ｈｓｐ９０α对体内肿瘤生长的影响及机理。方法 利用克隆技术构建了ｈｓｐ９０α融合表达质粒ｐＭａｌ－ｈｓｐ９０α。ＤＢＡ／２小鼠接种肿瘤细胞前,皮下注射融合蛋白,每隔１天测肿瘤大小,２５天后,＾５１Ｃｒ释放法测ＮＫ细胞活性。结果 注射热休克帽白组小鼠抗ｈｓｐ９０ａ抗体升高,肿瘤生长快,ＮＫ细胞活性低,结论 ｈｓｐ９０α对肿瘤生长的影响与不鼠体内的ＮＫ细胞活性降低有关。     

mtP53稳定性与化疗敏感性关系

目的 观察反义HSP70RNA对MCF-7／Adr人乳腺癌细胞耐药性影响，探讨其与mtP53稳定性和肿瘤耐药间的关系。方法 利用DNA重组技术构建反义人HSV70真核表达质粒pX—AHSP70，用脂质体方法将重组质粒转染至MCF-7／Adr人乳腺癌细胞，PCR确定转染细胞中外源DNA存在后，Western Blot检测HSP70蛋白的抑制程度。MTT法检测了对细胞耐药性的影响，P53稳定性实验分析反义HSP70RNA对mtP53半衰期的改变。结果 经G418筛选获得稳定表达反义HSP70RNA的细胞株MAp70，HSP70蛋白表达下降42％，细胞耐药性下降33．9％，P53稳定性实验表明，其胞内mtP53含量下降，半衰期缩短了6h，稳定性明显下降，以上参数与空载体MAX细胞相比，差异均有显著性。结论 反义HSP70RNA能够明显降低乳腺癌细胞的耐药性，提示HSP70可能通过增强mtP53稳定性的途径而参与肿瘤细胞耐药。