RNA干扰抑制环氧化酶-2表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的 建立以小分子干扰RNA(siRNA)抑制环氧化酶-2(COX-2)表达的宫颈癌HeLa细胞模型,探讨COX-2在肿瘤细胞增殖、凋亡方面的作用和可能机制.方法 构建靶向抑制COX-2的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,Western blot法确定筛选的稳定表达siRNA的转化克隆COX-2表达受抑制;流式细胞仪检测RNA干扰(RNAi)抑制COX-2表达后细胞凋亡和细胞周期的变化;克隆形成试验检测细胞克隆形成率;RT-PCR及Western blot法检测ku70、ku80的表达变化.结果 获得稳定表达siRNA的转化细胞株(HeLa/COX-2i),其COX-2蛋白表达明显受抑制,而转入阴性对照质粒的细胞株(HeLa/Negi)COX-2蛋白表达不受影响;HeLa/COX-2i细胞的克隆形成率[(45±4)%]显著低于HeLa细胞[(85±7)%](P<0.01);HeLa,HeLa/Negi,HeLa/COX-2i 3株细胞的细胞周期分布以及细胞凋亡率差异无显著性意义;RT-PCR及Western blot显示RNAi抑制COX-2表达后ku70、ku80在转录和翻译水平均受抑制.结论 RNAi抑制COX-2表达后可抑制HeLa细胞增殖,其机制可能与ku70、ku80的表达下调有关.     

短发夹状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

RNA干扰（RNAi）技术是运用双链RNA引发的转录后水平基因沉默机制,特异性抑制靶基因转录,进而下调相应蛋白表达水平及功能.新近的RNAi技术,是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA（shRNA）,特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译.与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域.利用RANi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性.     

PTEN基因对卵巢癌耐药细胞系C13K顺铂耐药性的影响

目的:探讨第10号染色体上PTEN对人卵巢癌顺铂耐药细胞株C13K顺铂耐药性的逆转作用。方法:将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染人卵巢癌耐药细胞系C13K细胞,同时以转染空载体和未转染C13K细胞作为对照,分别应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(W estern blot)检测PTEN mRNA及蛋白表达水平,对转染细胞株进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验,观察PTEN基因对肿瘤细胞生长的抑制作用和C13K细胞对顺铂药物敏感性的影响,流式细胞仪(FACS)分析细胞的凋亡。结果:转染48 h后,与对照组相比,转染野生型PTEN基因能明显增加C13K细胞PTEN mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);MTT法显示,转染野生型PTEN基因的C13K细胞生长明显慢于转染空载体和未转染的C13K细胞,转染PTEN的C13K细胞对顺铂的敏感性显著增加;FACS分析显示,顺铂作用24h后,转染PTEN基因能够显著提高C13K细胞凋亡率。结论:转染野生型PTEN质粒能有效地提高C13K细胞内PTEN的表达,恢复细胞对顺铂的敏感性。     

RNAi抑制Akt2基因表达对卵巢癌细胞系A2780放射敏感性的影响

背景与目的:许多研究已经表明蛋白激酶B(P13K/Akt)在肿瘤细胞恶性增殖及肿瘤对放化疗的拮抗中起着重要作用,Akt2是Akt家族成员之一.本研究应用RNAi(RNA interference,RNAi)技术抑制Akt2基因的表达,观察其对肿瘤细胞生长和放射敏感性的影响.方法:构建Akt2基因的短发卡状RNA质粒转染人卵巢癌细胞A2780,同时以转染空载体和未转染组作为对照,3组细胞命名为pAkt2-shRNA/A2780,pEGFP/A2780和A2780)运用RT-PCR、蛋白质免疫印迹方法比较转染前后Akt2表达的差异;四甲基偶氮唑蓝实验绘制细胞生长曲线;克隆形成实验观察细胞的放射敏感性变化,以克隆形成率表示;6 MV X线10 Gy照射后48 h收集细胞,流式细胞仪(FACS)分析细胞凋亡情况.结果:与对照相比,shRNA可抑制Akt2 mRNA转录和蛋白的表达,差异显著(P＜0.05);pAkt2-shRNA/A2780细胞生长明显慢于pEGFP/A2780和A2780细胞;pAkt2-shRNA/A2780细胞克隆形成率明显低于pEGFP/A2780细胞和A2780细胞(P＜0.05);pAkt2-shRNA/A2780,pEGFP/A2780和A2780细胞凋亡率分别为(78.3±2.2)%、(41.2±1.8)%和(40.4±2.0)%,差异有显著性(P＜0.05).结论:转染针对Akt2基因shRNA真核表达载体,抑制卵巢癌细胞中Akt2基因表达,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,增强其对放射治疗的敏感性.     

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

目的：构建AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体，观察RNA干扰（RNAi）技术，对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用，并探讨其促进细胞凋亡的机制。方法：运用基因工程技术，设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA，构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞，荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达，计算转染效率，半定量RT—PCR（Semi-quantitative RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测AKT2的表达及干扰效率，流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋亡率，比较抑制AKT2基因前后卵巢癌细胞抵抗凋亡能力。结果：成功构建了PAKT2-ShRNA载体。A2780和SKOV3细胞转染pAKT2-shRNA后，荧光显微镜下观察转染效率约40％；Semi-quantitative RT-PCR和Western blot检测结果示，转染后AKT2 mRNA和蛋白表达均显著降低。FACS检测结果显示，转染pAKT2-shRNA后，紫杉醇25nmol／L处理细胞12h，与空白对照组和阴性对照组相比，细胞凋亡率显著增加，P〈0．05。结论：构建的pAKT2-shRNA真核表达载体能有效抑制AKT2基因表达；运用RNAi技术，降低卵巢癌细胞中AKT2基因表达水平，能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡。     

人Bub1基因shRNA真核表达质粒的构建及其对人卵巢癌细胞SKOV3紫杉醇敏感性的影响

目的 构建人Bub1 shRNA真核表达质粒,鉴定该质粒对人卵巢癌SKOV3细胞中Bub1基因的抑制作用,并探讨其对SKOV3细胞紫杉醇敏感性的影响.方法 构建pEGFP-Bub1-shRNA质粒,将其经脂质体Lipo 2000TM转染SKOV3细胞后,通过RT-PCR及Western blot检测干扰效率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法比较转染前后SKOV3细胞的紫杉醇敏感性.结果 成功构建了pEGFP-Bub1-shRNA质粒;RT-PCR 和Western blot检测结果提示,转染后Bub1的mRNA和蛋白表达均显著降低;MTT和FACS提示,与对照组细胞相比,转染后SKOV3细胞生长抑制率及凋亡率明显降低(P<0.05).结论 pEGFP-Bub1-shRNA质粒能有效抑制Bub1 mRNA及蛋白的表达,并降低SKOV3细胞紫杉醇敏感性,该质粒的成功构建为进一步研究Bub1基因的生物学功能提供了工具.     

短发卡状RNA抑制人Bubl基因表达及其对人卵巢癌A2780细胞药物敏感性和周期的影响

背景与目的:既往研究提示,紫杉醇类药物作用的发挥有赖于功能完整的纺锤体检查点,而Bubl是纺锤体检查点的重要组成部分.本研究旨在探讨Bubl短发卡状RNA真核表达载体稳定转染对人卵巢癌A2780细胞紫杉醇敏感性及细胞周期的影响.方法:构建Bubl基因短发卡状RNA真核表达载体pEGFP-Bubl-shRNA,以脂质体Lipofectamine~(TM)2000包裹空质粒转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780后进行稳定筛选.应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表达情况:MTT法、流式细胞术等方法检测转染前后,A2780细胞对紫杉醇敏感性及其细胞周期的变化;Hoechst33342染色法检测细胞分裂指数.结果:与对照组pEGFP-Cl/A2780及A2780组相比,pEGFP-Bubl-ShRNA/A2780组细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显下降,其差异具有统计学意义(P＜0.05);MTT检测结果提示,转染pEGFP-Bubl-shRNA质粒后细胞对紫杉醇的敏感性明显降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,紫杉醇1 μ mol/L处理细胞24及48 h后,与pEGFP-Cl/A2780及A2780组相比,该组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),G_2/M期细胞比例下降,差异具有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33342染色提示,与对照组相比,pEGFP-Bubl-shRNA/A2780组的分裂指数(MI)明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:Bubl基因的下调可导致人卵巢癌A2780细胞对紫杉醇敏感性及G_2/M期细胞比例下降.pEGFP-Cl-shBubl质粒的成功构建,为研究Bubl基因的功能及定位的研究提供了进一步的实验条件.     

氯化锂对卵巢癌细胞增殖凋亡影响及其机制探讨

目的：观察氯化锂（1ithiumchloride,LiCl）对卵巢癌sKOV3细胞增殖活性及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：使用20（A组）、40（B组）和60（C组）mmol／LLiCl处理sKOV3细胞,正常对照组用等体积的细胞培养基培养。采用CCK8法观察LiCl对卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测LiCl作用后细胞周期变化及凋亡情况。蛋白质印迹法检测细胞糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthasekinase317,GSK-3β）、磷酸化糖原合成酶激酶-317（phos—phorglation—glycogensynthasekinase3β,p-GSK-3β）及有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitoticarrestdeficient2,MAD2）蛋白表达的变化。结果：不同浓度LiCl分别作用于SKOV3细胞48h后,A组细胞增殖活性为（80．64±1．06）％,与B组（57．18±1．56）％比较,差异有统计学意义,P=0．001;与C组（43．18±6．12）％比较,差异有统计学意义,P〈0．001。B组作用24h细胞增殖活性为（75．12±9．35）％,48h为（57．18±1．56）％,72h为（35．36±1．00）％,与24h组相比,48h组（P=0．158）和72h组（P=0．036）细胞增殖活性降低。LiCl能有效抑制SKOV3细胞增殖,呈时间与剂量依赖性。不同浓度LiCl作用96h后SKOV3细胞的凋亡率相对于对照组升高,A组为（7．82±0．87）％,P=0．037;B组为（21．09±1．57）％,P〈O．001;C组为（27．83士0．47）%,P〈O．001,差异均有统计学意义。不同浓度LiCl作用48h后,细胞出现了明显的G2／M期阻滞,G2／M期的比例由对照组的（10．23±1．50）％依次升高,A组为（19．9±4．16）％,P=0．352;B组为（30．29±0．51）％,P=0．045;C组为（39．32±1．11）％,P=0．009,差异有统计学意义。蛋白质印迹法检测结果显示,LiCl浓度升高,p-GSK-3β蛋白相对表达量升高,A组为（54．39±2．75）％,P=0．019;B组为（72．39土2．89）％,P=0．009;C组为（86．57±2．52）％,P=0．005,差并有统计学意义。LiCl浓度升高,MAD2蛋白相对表达量升高,A组为（52．29土1．34）％,P=0．041;B组为（58．35±1．36）％,P=0．030;C组为（72．07±2．93）%,4,P=0．006,差异有统计学意义。结论：LiCl能有效抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,并诱导其凋亡;上调MAD2增强有丝分裂检测点功能,最终导致细胞G2／M期阻滞可能是LiCl抑制增殖促进凋亡的机制。     

蛋白酶体抑制剂联合紫杉醇对卵巢上皮性癌细胞药物敏感性的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂波替单抗与紫杉醇单独作用及联合作用于卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞株SKOV3的效果,并对其诱导细胞凋亡的分子机制进行探讨.方法 波替单抗与紫杉醇单独或联合(50 nmol/L波替单抗、90 nmol/L紫衫醇或50 nmol/L波替单抗+90 nmol/L紫衫醇)作用于SKOV3细胞后,四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞增殖活性并计算细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(AKT)和磷酸化糖原合成酶激酶3β(CSK-3β)蛋白的表达水平.结果 波替单抗与紫衫醇联合作用于SKOV3细胞,12、24、36、48及72 h各时间点的细胞存活率分别为(65.2±5.8)%、(58.3±14.4)%、(35.3±5.0)%、(19.2±1.5)%和(11.4±2.5)%,与单用紫杉醇比较,细胞增殖抑制效果增强,各时间点分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).单用紫杉醇、单用波替单抗和两者联用的细胞凋亡率分别为(14.7±0.5)%、(15.1±0.8)%和(20.5±0.7)%,波替单抗与紫杉醇联用的细胞凋亡率明显增高,分别与单用紫杉醇或单用波替单抗比较,差异均有统计学意义(P<0.05).不同药物处理细胞后,磷酸化AKT和磷酸化GSK-3β蛋白的表达水平均有不同程度降低,以波替单抗与紫杉醇联用者降低最为明显[分别为(3.2±0.8)%、(19.3±0.4)%],分别与单用紫杉醇、单用波替单抗、正常未处理细胞比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 蛋白酶体抑制剂波替单抗与紫杉醇联用能增强卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性;AKT/GSK-3β信号通路可能在波替单抗与紫杉醇联用诱导细胞凋亡中发挥了重要作用.     

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

为观察构建的AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用，并探讨其促进细胞凋亡的机制。运用基因工程技术，设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA，构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞，荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达，