脊肌萎缩症治疗研究进展

脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种遗传性疾病,主要是由于运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1, SMN1)纯合子缺失或突变而导致,其特征是脊髓前角细胞变性和由此引起的肌肉萎缩和无力,目前该疾病还没有有效的治疗手段,本文简要概述了SMA的分子机制及其临床治疗研究进展。     

精胺氧化酶抑制剂的筛选及抗肿瘤活性评价

目的 筛选多胺代谢关键酶精胺氧化酶小分子抑制剂,并评价其对人肺癌A549细胞的精胺氧化酶活性抑制效应、抗肿瘤作用及分子机制。方法 以精胺和精胺氧化酶复合物结构为基础,用计算机辅助药物设计技术,在化学数据库中虚拟筛选获得候选的小分子抑制剂。以A549细胞为肿瘤细胞模型,利用化学发光法、HPLC法分析小分子抑制剂对精胺氧化酶活性抑制及多胺含量的影响;采用MTT法、流式细胞术检测小分子抑制剂对细胞增值、细胞周期、诱导细胞凋亡的影响;在倒置荧光显微镜、透射电子显微镜下观察小分子抑制剂诱导细胞自噬小体的形成;Western blot法分析小分子抑制剂对细胞周期蛋白(Cyclin B1、p21、Cyclin D)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、细胞色素C)和自噬相关蛋白(LC3、P62)表达的影响。结果 筛选出有效抑制精胺氧化酶活性的新型小分子抑制剂SI-1338,对精胺氧化酶的半数抑制浓度为880μmol·L^-1。SI-1338可有效抑制A549细胞中精胺氧化酶活性,干扰多胺代谢,减少总多胺的含量;抑制A549细胞的增殖,周期蛋白Cyclin B1、p21、Cyclin...     

萝卜硫素对小鼠乳腺癌4T1细胞上皮-间质转化、增殖和迁移的影响研究

背景与目的：组蛋白去乙酰化酶5（histone deacetylase 5,HDAC5）在乳腺癌组织中异常高表达,其与赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine specific demethylase,LSD1）协同促进乳腺癌细胞增殖和迁移。通过萝卜硫素（sulforaphane,SFN）下调HDAC5表达,观察其对小鼠乳腺癌4T1细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）、增殖和迁移的影响。方法：采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法分析SFN对4T1细胞增殖的影响。采用乳酸脱氢酶释放实验检测SFN的细胞毒性。采用pcDNA3.1(+)-FLAG-HDAC5质粒转染4T1细胞,通过G418筛选获得单个细胞克隆,再以蛋白质印迹法（Western blot）鉴定HDAC5蛋白稳定高表达的单克隆细胞系。采用划痕实验和transwell法分析过表达HDAC5以及SFN处理对4T1细胞迁移和侵袭的影响。采用Western blot检测SFN处理对4T1细胞EMT标志物上皮钙黏着蛋白（E-cadherin）、神经钙黏着蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）表达的影响。以4T1细胞的BALB/c小鼠移植瘤为模型,观察SFN对4T1细胞体内成瘤性、转移的影响及其与HDAC5表达的关系。采用免疫组织化学法检测小鼠原位肿瘤及肺转移瘤组织中Ki-67增殖指数。取荷瘤小鼠心、肝、肾组织,采用H-E染色检测SFN对荷瘤小鼠的毒性作用。结果：SFN能够抑制4T1细胞增殖（P＜0.01）,并抑制4T1细胞体外迁移和侵袭,而外源性过表达HDAC5可部分拮抗SFN对4T1细胞迁移和侵袭的抑制作用。SFN处理显著下调4T1细胞中HDAC5、MMP-9、N-cadherin和vimentin的表达,同时上调E-cadherin的表达。结论：SFN处理显著抑制4T1细胞在小鼠体内的成瘤性和肺转移,下调小鼠原位肿瘤和肺转移瘤组织中的Ki-67阳性率。过表达HDAC5可拮抗SFN对4T1细胞体内成瘤性和肺转移的抑制作用。SFN的抗乳腺癌作用与其诱导的HDAC5表达下调以及由此介导的EMT抑制作用密切相关。     

腺相关病毒衣壳蛋白修饰的研究进展

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的基因治疗在单基因遗传性疾病的临床治疗中取得了突破性进展.通过衣壳蛋白修饰来优化AAV载体,获得具有细胞靶向性、高转导能力和低或无免疫原性的AAV载体成为当前基因治疗研究的重点之一.目前,研究者主要通过合理设计、定向进化和化学修饰方法对AAV衣壳进行...     

AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：表达腺相关病毒（AAV）9型衣壳蛋白VP,制备抗VP蛋白的多克隆抗体。方法：使用PCR技术从AAV9病毒包装质粒中扩增AAV9衣壳蛋白VP,同源重组法构建衣壳蛋白表达质粒pET30a-AAV9-VP。质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白VP表达,亲和层析法纯化VP蛋白,将纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔,3次免疫后获得针对VP蛋白的兔多克隆抗体。以Western blot和细胞免疫荧光法检测抗体的应用,ELISA检测所得抗体的效价。结果：成功构建pET30a-AAV9-VP表达质粒,在大肠杆菌BL21中,IPTG可诱导VP蛋白表达。亲和层析法纯化获得高纯度的VP蛋白。该蛋白在日本大耳兔体内能够诱导产生多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价达到1∶512 000。结论：成功原核表达和纯化AAV9衣壳蛋白VP并制备了兔多克隆抗体。制备的抗AAV9 VP抗体能够特异性识别和结合AAV衣壳蛋白,并可有效用于Western blot和细胞免疫荧光分析,为后续深入研究AAV9在基因治疗中的作用及AAV9载体开发提供了研究基础。     

抑制多胺调节因子-1 表达增强地塞米松对人宫颈癌细胞的抗肿瘤活性

目的：探讨在人宫颈癌Caski 细胞中抑制多胺调节因子-1（polyamine-modulated factor, PMF-1）表达对糖皮质激素类药物地塞米松(dexamethasone, DEX）抗肿瘤作用的影响。方法: 设计合成靶向人PMF-1 基因的siRNA,Western blotting 法鉴定其对Caski 细胞PMF-1 中表达的影响。用DEX处理PMF-1 表达抑制的Caski 细胞和对照细胞,然后分析PMF-1 表达下调是否影响瘤细胞对DEX的敏感性。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,Western blotting 法测定糖皮质激素受体（glucocorticoids receptor, GR）的表达水平,高效液相色谱法分析细胞内的多胺含量。结果: 用靶向PMF-1 基因的siRNA 瞬时转染Caski 细胞能显著性下调细胞中PMF-1 蛋白的表达水平。与对照细胞相比,用DEX处理PMF-1 表达下调的Caski 细胞能更有效地抑制细胞增殖(P<0.01),上调细胞内GR表达水平(P<0.01),并显著抑制细胞分裂导致G2 周期阻滞(P<0.01),同时能显著性地降低细胞内的多胺水平(P<0.01)。结论: 抑制PMF-1 表达可增强DEX对人宫颈癌细胞的抗肿瘤活性,其机制可能与降低细胞内多胺水平和增强细胞周期阻滞相关。     

腺相关病毒衣壳保守区多价抗原肽的原核表达及多克隆抗体制备

目的 原核表达和纯化腺相关病毒（AAV）衣壳保守区抗原肽,制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法 设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA,将序列克隆到载体pET30a,获得质粒pET30a-AAV-CR,原核表达并纯化保守区多价抗原肽,考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组（1只/组）,实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体,对照组注射PBS,ELISA检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果 成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR,表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质;纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体,且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论 诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体,为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。     

高表达OAZI-1的小鼠乳腺癌4T1细胞诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的在细胞和实验动物水平上分析高表达OAZI-1对小鼠乳腺癌4T1细胞诱导抗肿瘤免疫应答的影响。方法 RT-PCR和Western blot用于鉴定高表达OAZI-1的4T1细胞(4T1/OAZI-1);流式细胞仪检测Mφ下同和DC对4T1细胞的吞噬率以及成熟DC标志性表面分子的表达水平;ELISA检测细胞培养上清和小鼠血清中IFN-γ和TNF-α含量。用4T1/OAZI-1和4T1/3.1对照细胞分别接种Balb/c小鼠后,观察接种瘤的生长状况及荷瘤小鼠的生存期。结果 1)成功构建OAZI-1高表达的4T1/OAZI-1细胞株;2)M?和DC对4T1/OAZI-1细胞的吞噬率(10.8%,58.4%)显著高于对照细胞(6.3%,19.6%);3)将DC与4T1/OAZI-1共孵育后,CD40、CD80和CD86(成熟DC细胞表面标志分子)表达阳性的DC比率(62.8%、77.9%和75.1%)显著高于和对照细胞共孵育的DC(43.9%、57.5%和49.6%);4)将4T1/OAZI-1活化的DC与Balb/c小鼠脾淋巴细胞共孵育后,细胞培养上清中IFN-γ含量(28.7 pg/ml)显著高于对照细胞(19.4 pg/ml);5)将4T1/OAZI-1和4T1/3.1细胞分别接种Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下,小鼠体内4T1/OAZI-1接种瘤的生长速度显著低于对照细胞接种瘤,其生存期和血清TNF-α和IFN-γ水平也明显高于接种对照细胞的小鼠。结论高表达OAZI-1的小鼠乳腺癌4T1细胞能更有效地被抗原提呈细胞识别、吞噬并诱导T淋巴细胞活化与成熟,诱导机体的抗肿瘤免疫应答,抑制接种瘤在动物体内的生长。     

OAZI-1 蛋白复合物在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应的研究

目的:在实验动物的水平上分析来源于肿瘤细胞的鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(Ornithine decarboxylaseantizyme inhibitor-1,OAZI-1) 蛋白复合物能否在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应。方法:用包被有OAZI-1 抗体的免疫磁珠从B16-F1 小鼠黑色素瘤细胞中分离OAZI-1 蛋白复合物,用此复合物免疫小鼠后, 再在小鼠皮下接种B16-F1 活细胞,然后观察接种瘤在小鼠体内的成瘤及生长状况。ELISA 法用于检测免疫小鼠血清中IFN-γ含量。乳酸脱氢酶释放实验(LDH)检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞对B16-F1 细胞的杀伤效应。上述动物实验用原核表达纯化的OAZI-1 蛋白和PBS 免疫的小鼠作为对照。结果:与对照小鼠相比,接种OAZI-1 蛋白复合物的小鼠脾淋巴细胞(效应细胞)对B16-F1 黑素瘤细胞(靶细胞)具有更强的杀伤能力。在三种不同的效：靶比下(10 ：1、50 ：1、100 ：1),该组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性分别为46.2%、59.5% 和92.5%,显著性高于接种纯化OAZI-1 蛋白组(36.1%、26.8% 和45.9%)和接种PBS 组(24.6%、24.0% 和27.2%)小鼠脾淋巴细胞。此外,接种OAZI-1 蛋白复合物的小鼠血清中抗肿瘤细胞因子IFN-γ含量(538.3 pg/ ml)也显著性高于接种纯化OAZI-1 蛋白组(256.2 pg/ ml)和接种PBS 组(131.0 pg/ ml)小鼠。上述方法免疫的小鼠在皮下再接种B16-F1 活细胞后,免疫OAZI-1 蛋白复合物组小鼠成瘤率为40%,而PBS 组和纯化OAZI-1 蛋白组小鼠成瘤率为100%,且接种瘤在OAZI-1 蛋白复合物免疫小鼠体内生长更为缓慢。结论:从B16-F1 肿瘤细胞中分离的OAZI-1 蛋白复合物中可能含有肿瘤抗原,用此复合物接种小鼠能在实验动物体内诱导抗肿瘤免疫杀伤活性。     

新型精胺氧化酶抑制药对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响北大核心CSCD

目的研究新型精胺氧化酶抑制药SI-4650对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法将SGC-7901细胞分为空白组(正常培养)、低、高剂量实验组(40、80μmol·L^(-1)SI-4650)、自噬抑制药3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(2.5 mmol·L^(-1)3-MA)、3-MA+低、高剂量实验组(2.5 mmol·L^(-1)3-MA+40、80μmol·L^(-1)SI-4650),均处理48 h。用化学发光法检测细胞中精胺氧化酶(SMO)活性,用细胞计数8(CCK8)法和流式细胞术检测细胞增殖和周期,用碘化丙啶(PI)/异硫氰酸荧光素(FITC)-Annexin V双染法检测凋亡细胞情况,用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白微管结合蛋白轻链-3Ⅰ/Ⅱ(LC3-Ⅰ/Ⅱ)表达水平。结果空白组与低、高剂量实验组中人胃癌SGC-7901细胞中相对SMO酶活性分别为(7293±195)、(4506±195)、(989±115)RLU·(mg·s)^(-1),S期细胞比例分别为(28.83±1.17)%、(32.23±1.21)%、(36.50±0.73)%,低、高剂量实验组与空白组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。空白组与低、高剂量实验组以及3-MA组与3-MA+低剂量实验组、3-MA+高剂量实验组中可见,细胞生长抑制率分别为(0.00±2.09)%、(43.61±2.29)%、(52.16±2.49)%、(1.81±4.43)%、(27.50±1.88)%、(34.22±1.07)%,细胞凋亡率分别为(7.01±2.09)%、(13.16±1.59)%、(25.35±2.32)%、(7.13±2.09)%、(8.61±1.59)%、(11.35±2.32)%,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为0.01±0.03、0.58±0.04、2.73±0.03、0.03±0.01、0.06±0.02、0.23±0.03。低、高剂量实验组与空白组相比,低、高剂量实验组与对应浓度3-MA+低、高剂量实验组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论SI-4650能高效抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,机制可能与干扰多胺代谢、阻滞细胞周期S期和诱导细胞自噬、凋亡相关。