南方红豆杉转录组SSR位点分析及其分子标记开发

目的 基于赤霉素（gibberellin A₃,GA₃）处理下的南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei转录组数据鉴定和分析SSR位点,开发可用于南方红豆杉种质资源鉴定和遗传多样性分析的SSR标记。方法 使用MISA软件对南方红豆杉转录组数据进行SSR分析,搜索SSR位点。可搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸,最小重复数分别设置为10、6、5、5、5、5次。采用Primer 3（2.3.5版,默认参数）进行SSR引物设计。通过毛细管荧光电泳检测,最终选定多态性好,扩增成功率高的SSR引物用于后续数据分析;通过MEGA进行UPGMA聚类分析,构建聚类树。结果 转录组测序共获得202 361条Unigene,采用MISA软件搜索出12 008个SSR位点,分布在10 894条Unigenes上,发生频率为5.38%,平均距离为1/7.64 kb。单核苷酸重复类型最丰富,占总SSR位点的51.74%,其次为三核苷酸（20.92%）和二核苷酸重复类型（20.88%）。A/T、AG/CT是优势重复基序,分别占总SSR重复类型的49.60%和10.93%。随机抽选96对SSR引物,以4个地区12份南方红豆杉种质进行引物有效性和多态性验证,筛选出13对具多态性的SSR引物,多态性引物比率为13.54%。13对引物在东北红豆杉Taxus cuspidata扩增效率高达100%,但在曼地亚红豆杉Taxus × media扩增效率仅为23.08%。聚类分析表明太行山地区南方红豆杉聚为一类,浙江、福建和湖南等南方来源的南方红豆杉聚为一类,后三者彼此之间遗传距离更近。结论 南方红豆杉转录组测序产生的Unigene信息可以用来开发SSR分子标记,开发的13个标记将有助于南方红豆杉物种遗传多样性、分子育种、资源保护等方面的研究。     

西伯利亚白刺L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因克隆与序列分析

目的 克隆西伯利亚白刺Nitraria sibirica维生素C合成过程中L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP）编码基因。方法 利用生物信息学方法对西伯利亚白刺三代转录组数据进行分析,共鉴定出2个GPP基因,并从西伯利亚白刺中成功克隆得到2条NsGPP基因序列,进一步利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构、保守序列以及系统进化等进行分析,并结合RNA-seq数据分析其在盐胁迫下的表达模式,利用qRT-PCR实验检测其在不同组织中的表达水平。结果 从西伯利亚白刺中成功鉴定克隆出2个NsGPP基因,2个NsGPP基因所编码蛋白均含有保守的FBPase/IMPase/glpX-like（FIG）结构域,且与其他植物GPP蛋白具有较高的相似性。利用多个物种的GPP蛋白序列构建系统进化树,结果显示西伯利亚白刺与灌木或半木质化草本植物亲缘关系更近。Motif分析发现NsGPP蛋白与拟南芥等GPP蛋白较为相似,但也存在差异,并且2个NsGPP蛋白之间也存在差异。此外,NsGPP1与NsGPP2的蛋白三维结构之间也存在微小差别。RNA-seq分析表明,不同浓度NaCl处理下,NsGPP1的表达逐步升高的趋势,而NsGPP2的表达量则较低,且在盐胁迫后其表达水平逐渐降低。qRT-PCR实验结果显示,白刺GPP基因的表达存在组织表达特异性,且在同一组织中NsGPP1的表达水平显著高于NsGPP2。结论 从西伯利亚白刺中成功克隆到2个NsGPP基因,其编码蛋白均含有保守的FIG结构域,且与拟南芥等草本植物的GPP蛋白更为相似。NsGPP基因在不同组织中表达水平具有显著差异,其中NsGPP1可能参与西伯利亚白刺维生素C生物合成并参与白刺抵抗盐胁迫。为进一步解析白刺维生素C生物合成以及耐盐分子机制提供了理论依据。     

红豆杉属植物中紫杉烷化合物含量比较与分析

目的分析和比较5种红豆杉中6种紫杉烷类化合物含量的差异。方法利用乙醇超声浸提后得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和相关性分析、回归分析和聚类分析比较紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-deacetyltaxol,10-DAT)、三尖杉宁碱和10-去乙酰基-7-木糖基紫杉醇(10-deacetyl-7-xylosetaxol,DXT)含量。结果不同种红豆杉紫杉烷含量存在显著性差异,陇南地区中国红豆杉中10-DAB、紫杉醇、10-DAT和三尖杉宁碱含量显著高于其他种红豆杉,曼地亚红豆杉和湖南省南方红豆杉中10-DAB含量也相对较高;相关性分析、回归分析及聚类分析均表明,10-DAT和三尖杉宁碱与紫杉醇含量显著相关,且前者比后者对紫杉醇含量的影响作用更大;聚类分析还表明温室内栽植的南方红豆杉聚为一类,大田种植的中国红豆杉、东北红豆杉、太行山地区南方红豆杉和曼地亚红豆杉聚为一类,表明环境因子对紫杉烷积累具有明显影响。结论不同种红豆杉中紫杉烷含量具有显著差异,种类是影响红豆杉紫杉醇等紫杉烷含量的重要因素,紫杉醇含量随着10-DAT和三尖杉宁碱含量增加而增加。