用人肝细胞cDNA文库制备Dig-Fas探针

为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系 ,本文采用降落PCR技术、分子克隆技术和Fas特异性引物 ,将从人肝细胞cDNA文库中扩增的FascDNA插入T -easyvector中 ,转染JM10 9,经耐药性和lacZ插入失活筛选 ,快速细胞裂解法、限制性内切酶酶切片段和PCR扩增试验分析鉴定 ,确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见方法 ,标记扩增、分离和纯化的FascDNA ,经斑点免疫实验证实获高滴度Dig -FascDNA探针     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

RI与ANG相互作用对BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤生长转移及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目的探讨核糖核酸酶抑制因子(RI)与血管生成素(ANG)相互作用对BALB/C裸鼠人膀胱癌(cloladder cancer)移植瘤的生长转移及对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。方法构建BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤模型,通过HE染色、免疫组织化学染色、免疫荧光和免疫印迹法检测相关通路蛋白的表达情况。根据不同的组合分为:BIU-87+ANG,BIU-87+RI,BIU-87+ANG+RI和BIU-87+空质粒组,每组接种6只BALB/C裸鼠。结果接种后一周左右皮下有实体瘤生成,30天后处死BALB/C裸鼠,取出肿瘤并称取其重量。实验组BIU-87+RI和BIU-87+ANG+RI组比对照组的肿瘤重量低,差异具有统计学意义(P0.05)。肺HE染色观察显示实验组肺部转移结节明显比对照组少,BIU87+ANG组中p-mTOR,p-PI3K,p-Akt和p-GSK3β表达升高,BIU87+RI组和BIU-87+ANG+RI组表达下降。结论 RI与ANG相互作用抑制BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤的生长转移,同时抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中磷酸化蛋白的水平。     

葡萄糖转运体9基因 rs3733591（C>T）的单核苷酸多态性与我国汉族人群原发性痛风发病的相关性研究

目的探讨葡萄糖转运体9（SLC2A9）基因 rs3733591（C>T）的单核苷酸多态性（SNPs）与我国汉族人群痛风发病及血尿酸水平的相关性,并分析其多态性与痛风患者、健康体检者 PBMCs SLC2A9 mRNA 表达的相关性。方法①采用 TaqMan?探针法检测痛风组（297例原发性痛风性关节炎患者）和健康对照组（211名健康体检者） rs3733591（C>T）位点的基因型,χ2检验比较2组基因型及等位基因分布频率,计算比值比（OR）及95%可信区间（95%CI）。②采用实时荧光定量-PCR（RT-qPCR）法检测46例间歇期痛风患者及40名健康对照组 PBMCs SLC2A9 mRNA 的表达水平,非参数检验比较各组变量间的差异,并分析与 rs3733591（C>T）多态性的相关性。结果 rs3733591（C>T）位点的 TT 基因型在痛风组的分布频率显著低于健康对照组（37.7%与48.3%,P=0.017）,携带 TT 基因型的个体罹患痛风的相对风险OR 为0.647（95%CI：0.452~0.925）。而等位基因 T 在痛风组中的分布频率为60.9%,显著低于健康对照组的69.2%（χ2=7.324,P=0.007）,携带等位基因 T 的个体罹患痛风的相对风险 OR 为0.695（95%CI：0.533~0.905）;等位基因 C 在痛风组中的分布频率为39.1%,显著高于健康对照组的30.8%（χ2=1.440,P<0.05）。痛风组中携带 TC 基因型个体的外周血单个核细胞 SLC2A9 mRNA 的表达水平显著高于携带 TT 基因型者,而痛风组及健康对照组携带其他基因型的个体 SLC2A9 mRNA 的表达差异无统计学意义（P>0.05）。有痛风石（30例）痛风患者与无痛风石（190例）痛风患者的基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义（P>0.05）。结论本研究提示 SLC2A9基因 rs3733591（C>T）位点的多态性可能与我国汉族人群原发性痛风的易感性相关,而与痛风患者痛风石形成无关;等位基因 C 可能为痛风发病的风险因子,而 TT 基因型及 T 等位基因可能对痛风发病具有保护作用;其多态性可能通过影响 SLC2A9基因的转录表达水平来参与痛风的发病。     

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的 构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGKINVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础.方法 将invA基因克隆于pGKble24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGKINVA.质粒pGKINVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株.结论 从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGKble24构建重组穿梭质粒pGKINVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在Korthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株.结论 成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGKINVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析.     

核酸酶与自身免疫性疾病

核酸酶在DNA损伤修复和基因组稳定性中起重要作用,而近年发现一些核酸酶的功能异常与多种自身免疫性疾病的发病机制相关。现重点就核酸酶TREX1和Mre11复合物(MRN)等在常见的自身免疫性疾病中的研究进展做一综述。     

丹参诱导类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞中Fas/FasL的表达

目的 观察丹参对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者成纤维样滑膜细胞中Fas/FasL mRNA表达的影响.方法 RA患者关节滑液经原代培养,获取成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs),分别用终浓度为0、0.2 mg/ml和0.4 mg/ml的丹参作用24 h后,提取总RNA并逆转录成cDNA保存.随机选取正常人外周血,通过分离单个核细胞提取总RNA并逆转录成cDNA保存作为阳性对照.分别采用RT-PCR和SYBR Green适时荧光定量PCR方法检测Fas/FasL mRNA的表达.结果 RT-PCR结果显示,FasL只在外周血标本上有表达,而在各浓度处理的RA FLSs没有检测到;Fas无论在外周血还是不同浓度处理的RA FLSs上均有表达.定量PCR结果显示,Fas的表达量随丹参浓度增加而增加,并且在丹参浓度为0.4 mg/ml时具有统计学差异(P<0.05).Fas mRNA的表达与相应浓度下RA FLSs的凋亡率存在相关性(r=0.998,P<0.05).结论 丹参可体外诱导RA患者成纤维样滑膜细胞Fas mRNA表达上调;未检测到FasL mRNA在RA患者FLSs中的表达.Fas mRNA的上调可能与丹参诱导RA FLSs凋亡有关.     

临床分子生物学检验实习的带教体会

随着医学科学的进步,临床对疾病的诊断和鉴别诊断越来越离不开检验医学,而传统的检验医学技术已不能满足临床的需要,分子生物学检验已成为检验医学重要的组成部分,并发挥着越来越重要的作用。分子生物学检验以聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术为核心,广泛地运用于临床,如感染性疾病的诊断、白血病融合基因检测、     

家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对人髓样白血病细胞K 562选择性杀伤作用的研究

目的：利用脂多糖刺激家蝇胚胎细胞产生并提取抗菌蛋白,对比研究家蝇胚胎细胞抗菌蛋白和高三尖杉酯碱（HHT）对人髓样白血病细胞K562和正常人体细胞的抑制杀伤作用。方法采用含20mg/L脂多糖的无血清M3培养基作用于处于对数生长期的家蝇胚胎细胞16h,提取上清液中的抗菌蛋白,将抗菌蛋白配制为40、80、160、320和640μg/mL5个浓度组,采用MTT法测定各浓度抗菌蛋白对K562和人脐静脉血管内皮细胞的抑制作用。将处于对数生长期的K562细胞和人脐静脉血管内皮细胞配制成相同浓度的HHT组、家蝇胚胎细胞抗菌蛋白组,两种细胞均采用自身设置对照组。采用流式细胞术测定K562细胞和人脐静脉血管内皮细胞3组药物的有效杀伤率。结果MTT法检测显示,5种浓度抗菌蛋白对K562细胞均具有明显抑制作用,各浓度抗菌蛋白对人脐静脉血管内皮细胞均无抑制作用。对照组、HHT组及家蝇胚胎细胞抗菌蛋白组对K562细胞的有效杀伤率分别为（28．16±2．14）％、（81．41±1．95）％和（82．90±3．03）％;对人脐静脉血管内皮细胞的有效杀伤率分别为（41．13±2．51）％、（82．20±2．57）％和（36．68±1．86）％。结论家蝇胚胎细胞抗菌肽与常用的白血病化疗药物相比,优点在于能有效杀伤白血病细胞又不损伤正常人体细胞。