寨卡病毒NS1单克隆抗体制备及其在临床诊断中的应用

目的用寨卡病毒非结构蛋白NS1免疫小鼠并制备鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA方法检测寨卡病毒NS1蛋白。方法合成NS1基因序列构建真核表达载体pcDNA3.1-NS1,转染HEK293细胞收集上清,经Ni+柱亲和层析法纯化NS1蛋白。以纯化的NS1重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取脾脏进行细胞融合,筛选阳性细胞株,经酶联免疫吸附检测抗体活性和特异性。结果成功表达并纯化NS1重组蛋白,获得7株单克隆抗体,筛选非竞争单抗组合建立捕获ELISA法,该方法可特异性识别NS1重组蛋白,最低检出限为1 ng/ml,且未与其他黄病毒属病毒发生交叉反应。结论成功制备特异性抗寨卡病毒NS1蛋白的鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA法,为寨卡疫情的进一步防控奠定了基础。     

重组酶介导的肠出血性大肠杆菌O157:H7等温扩增方法的建立

目的：建立新的快速检测常见食源性致病微生物肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157：H7的方法。方法：根据EHECO157：H7保守区序列,结合重组酶介导的恒温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和荧光定量或胶体金侧向流免疫层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD),建立两种EHEC O157：H7检测方法(RAA荧光法和RAA-LFD法)并进行优化,评估这两种方法的灵敏性及特异性。结果：两种检测方法均可在39 ℃恒温条件下16 min内完成检测,两种方法的检测限均可达1×104 拷贝数,具有较高的灵敏性。两种方法与其他常见的肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、弯曲菌、 耶尔森菌、志贺杆菌)质粒模板无交叉反应,具有良好的特异性。结论：本研究建立的两种检测EHEC O157：H7的方法,检测时间短并具有较好的特异性、灵敏性和重复性,可用于EHEC O157：H7的快速检测。     

人源抗TLR4抗体IgG2对对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

目的：研究人源抗TLR4 抗体IgG2（human?TLR4 IgG2,hTLR4 IgG2）对对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）诱导肝损伤的保护效应,探讨其在药物性肝损伤中的保护作用。方法：以人源抗TLR4 抗体Fab基因为模板,扩增其可变区基因,构建人源抗TLR4抗体IgG2真核表达载体,转染CHO?S细胞,筛选稳定表达细胞株,收集细胞上清,Protein G柱纯化抗TLR4抗体IgG2。将18只C57BL/6J 小鼠随机分成3组：生理盐水组、APAP（600 mg/kg）组和APAP +hTLR4 IgG2（5 mg/kg）组,统计小鼠腹腔注射APAP后 24 h的存活率;重复上述实验分组,检测小鼠腹腔注射APAP 8 h后,血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）、白细胞介素?1（interleukin?1,IL?1）、白细胞介素?6（interleukin?6,IL?6）和肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor?α,TNF?α）的表达水平,取肝脏做病理分析并使用Western blot检测凋亡蛋白的表达。结果：成功构建并表达纯化人源抗TLR4抗体IgG2;ELISA结果显示,抗体效价为1∶204 800。与APAP组相比,APAP+hTLR4 IgG2组小鼠的24 h存活率显著增加（P < 0.05）;血清AST、ALT以及炎性细胞因子的表达水平显著降低,具有统计学意义（P < 0.05）;病理分析结果显示,与模型组相比,人源抗TLR4抗体IgG2治疗组的小鼠肝组织炎性细胞浸润、充血和坏死等症状明显改善;Western blot结果显示凋亡相关蛋白的表达减少。结论：人源抗TLR4抗体IgG2能够抑制炎症因子的表达及细胞凋亡,对APAP诱导的小鼠肝损伤有显著的保护作用。     

抗鼠疫抗原F1的嵌合抗体制备及特性分析

目的：建立抗鼠疫F1嵌合抗体的稳定表达细胞系,表达并纯化嵌合抗鼠疫F1抗体并鉴定其活性。方法：提取鼠源杂交瘤细胞株4C6总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA,cDNA）,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）获得抗F1抗体轻链、重链可变区基因,全基因合成嵌合抗体的重链和轻链基因,并克隆于真核表达载体pMH3质粒中,共转染入中国仓鼠卵巢上皮细胞?S（Chinese hamster ovary cell?S,CHO?S）中,经遗传霉素（geneticin,G418）筛选得到稳定表达F1嵌合抗体的细胞株,悬浮培养后收集上清并亲和纯化。采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测其与F1抗原的特异性结合能力;通过竞争性ELISA比较嵌合抗体和鼠源亲本抗体与抗原的结合能力,同时测定抗体亲和力和质谱分析抗体特性。结果：成功获得稳定分泌抗鼠疫抗原F1 嵌合抗体的稳定表达细胞系,该抗体能够特异性结合F1抗原,抗体的亲和力为2.303×10-9 mol/L。结论：成功制备了抗体鼠疫F1的嵌合抗体,为后续动物体内实验及临床药物研发奠定了基础。